知道基因及rs号，要做PCR酶切，如何设计引物？

Posted 2023-04-24

帮师姐做，文献找的引物P不出来，只能重新设计合成，求具体步骤，感激不尽！

文献的引物你可以再摸一下PCR的条件，如果还不行的话就自己设计：通过ncbi获得基因序列及SNP的侧翼序列，可以相对扩展的长一些，然后用primer5设计，送公司合成就行了 参考技术A rs号？就是指的序列吧
你用Oligo7试过吗 文献给的引物极大可能是没错的 是不是你模板不纯 或者PCR体系问题
设计引物很简单的 特别是实际操作中（考试题目里面倒是麻烦许多）
不要想太多 就把重叠的部分搞好就对了 重叠大约19-22bp 模板是质粒最好追问

额。。。不会用。。。因为是做基因多态性的，现在知道突变的位点及rs号，我blast过引物确实没问题，可是一直都P不出条带，很无语，已经调过体系以及条件了，而且用其他基因的引物是可以P出很好的条带的，条件都一样，所以我觉得是引物的问题，现在想重新设计引物，但是不知道要怎么做。。。。求大神相助。。。

追答

已经调过体系以及条件了，而且用其他基因的引物是可以P出很好的条带的，条件都一样
不同引物有不同的条件 退火温度要看GC含量的 一般GC高就58度
引物出问题的可能很小 而且引物想改也改不了 因为要与模板结合 改动的地方十分有限
试试删去一些无意义碱基吧 比如酶切位点的保护碱基 没用的linker什么的
blast也可以 没必要非得某个软件 既然blast说可以 那就是说明没有其他的非特异性结合位置了 也许你重叠的区域比较短吧
还有你的基因组模板验证过了吗

关于重叠PCR加的那20bp，求大虾解答！在线等！

您好哈！看到了您在百度知道上对重叠PCR的回答，我想冒昧请教几个关于重叠PCR的问题，很期待得到您的解答！假设要融合的两基因是A（信号肽），B（目的基因），百度文库上说在A2的3端加20bpB基因的5端序列，在B1的3端加20bpA基因的3端序列，两个20bp为互补序列。
我的第一个疑惑是:既然两个20bp为互补序列，那么A1的3端加的那20bp是不是既可以是A基因序列3端序列之后的20bp也可以是B基因序列5端前的20bp，加的那20bp在不是ORF之外才好吗？还是说应该和引物序列构成完整的ORF呢？
第二个疑惑是：加的20bp不是3的倍数，会影响读框的移码问题吧？可以加21个或者18个吧？
第三个疑惑是，按照PCR流程，A2加的20bp是不是应该加在A2的5端呢，下游引物的3端是负责延伸的啊，也看到了一份资料说是直接吧B1全部加在A2的5端，A2全部加在B1的5端。
急待大虾的解答！

你为啥一定要我来这里答呢……感觉你想的比较多，把自己难住了
设四条引物为AfAr & BfBr
我一般用目的序列A下游12个，加上目的序列B上游12个，写在一起作为中间那对儿引物，这两条引物即Ar和Bf，是完全互补的两条链，而Af和Br就是普通的PCR引物。
使用的时候，AfAr是一个体系，BfBr是一个体系，先扩增出上下游产物
之后将上下游产物回收，放一起，只加Af和Br扩增。此时，中间那对儿overlapping引物呢，经过程序中五个融合循环，就靠互补作用粘到一起了，接下来扩增出来的就是一条融合了AB的长序列了追问

呵呵，Ar和Bf不用考虑引物的一些原则么。。

追答

呵呵用啊，所以才需要设计啊。
在基因A的下游，基因B的上游找一段序列，按照阅读框一个一个套，直到找到最合适的一段。最理想的情况是纯表达，就是直接用A尾和B头。
因为短，通常纯表达是可以的，或者挪个六到十二个就差不多了。

追问

恩恩，谢谢哈！知道了~A基因的3端10bp序列加到A25端，B基因的5端11bp加到B1的5端，是吗？

追答

不行，太短了！！
你要做至少12bp
A的3端互补序列加到A25端
B的5端加到B15端

追问

互补序列一共是21bp啊！谢谢你这么耐心地帮我！

追答

不客气宝贝儿，祝你一次成功

来自：求助得到的回答 参考技术A 你没有弄明白为什么要加着20bp，并不一定必须是20，一般来说满足16个以上的就行，他的目的就是把两段PCR产物连接在一起，就你的疑问中的20bp来说，这个20bp到最后是重合在一起的，也就是说最终的产物这20个bp就只有一个，而且这20bp是原来模板序列中就有的，打个比方，我现在序列是11223344556677889900这条序列分开合成，拆分成11223344和556677889900，那我就得这么做，第一条链为11223344556，第二条链则为344556677889900，然后再用最两头的引物做PCR，最后就是11223344556677889900了。你只要明白了这20bp加进去的目的以及这个实验的设计方案你就不会有第二问了。追问

第三个疑惑是，A基因的3端10bp序列加到A25端，B基因的5端11bp加到B1的5端，是吗？

参考技术B 什么20bp，引物的位置吗？关于20bp的虾米呢追问

就是做重叠PCR设计的引物比一般的引物多加的那20bp呢，A基因的下游和B基因的上游要多加的20bp，这两个20bp还要互补、、