关于重叠PCR加的那20bp，求大虾解答！在线等！

Posted 2023-03-18

您好哈！看到了您在百度知道上对重叠PCR的回答，我想冒昧请教几个关于重叠PCR的问题，很期待得到您的解答！假设要融合的两基因是A（信号肽），B（目的基因），百度文库上说在A2的3端加20bpB基因的5端序列，在B1的3端加20bpA基因的3端序列，两个20bp为互补序列。
我的第一个疑惑是:既然两个20bp为互补序列，那么A1的3端加的那20bp是不是既可以是A基因序列3端序列之后的20bp也可以是B基因序列5端前的20bp，加的那20bp在不是ORF之外才好吗？还是说应该和引物序列构成完整的ORF呢？
第二个疑惑是：加的20bp不是3的倍数，会影响读框的移码问题吧？可以加21个或者18个吧？
第三个疑惑是，按照PCR流程，A2加的20bp是不是应该加在A2的5端呢，下游引物的3端是负责延伸的啊，也看到了一份资料说是直接吧B1全部加在A2的5端，A2全部加在B1的5端。
急待大虾的解答！

你为啥一定要我来这里答呢……感觉你想的比较多，把自己难住了
设四条引物为AfAr & BfBr
我一般用目的序列A下游12个，加上目的序列B上游12个，写在一起作为中间那对儿引物，这两条引物即Ar和Bf，是完全互补的两条链，而Af和Br就是普通的PCR引物。
使用的时候，AfAr是一个体系，BfBr是一个体系，先扩增出上下游产物
之后将上下游产物回收，放一起，只加Af和Br扩增。此时，中间那对儿overlapping引物呢，经过程序中五个融合循环，就靠互补作用粘到一起了，接下来扩增出来的就是一条融合了AB的长序列了追问

呵呵，Ar和Bf不用考虑引物的一些原则么。。

追答

呵呵用啊，所以才需要设计啊。
在基因A的下游，基因B的上游找一段序列，按照阅读框一个一个套，直到找到最合适的一段。最理想的情况是纯表达，就是直接用A尾和B头。
因为短，通常纯表达是可以的，或者挪个六到十二个就差不多了。

追问

恩恩，谢谢哈！知道了~A基因的3端10bp序列加到A25端，B基因的5端11bp加到B1的5端，是吗？

追答

不行，太短了！！
你要做至少12bp
A的3端互补序列加到A25端
B的5端加到B15端

追问

互补序列一共是21bp啊！谢谢你这么耐心地帮我！

追答

不客气宝贝儿，祝你一次成功

来自：求助得到的回答 参考技术A 你没有弄明白为什么要加着20bp，并不一定必须是20，一般来说满足16个以上的就行，他的目的就是把两段PCR产物连接在一起，就你的疑问中的20bp来说，这个20bp到最后是重合在一起的，也就是说最终的产物这20个bp就只有一个，而且这20bp是原来模板序列中就有的，打个比方，我现在序列是11223344556677889900这条序列分开合成，拆分成11223344和556677889900，那我就得这么做，第一条链为11223344556，第二条链则为344556677889900，然后再用最两头的引物做PCR，最后就是11223344556677889900了。你只要明白了这20bp加进去的目的以及这个实验的设计方案你就不会有第二问了。追问

第三个疑惑是，A基因的3端10bp序列加到A25端，B基因的5端11bp加到B1的5端，是吗？

参考技术B 什么20bp，引物的位置吗？关于20bp的虾米呢追问

就是做重叠PCR设计的引物比一般的引物多加的那20bp呢，A基因的下游和B基因的上游要多加的20bp，这两个20bp还要互补、、

用MATLAB建立bp神经网络模型，求高手，在线等

邮箱[e-mail]，谢！！！
自己解决了……谢各位……

Matlab神经网络工具箱提供了一系列用于建立和训练bp神经网络模型的函数命令，很难一时讲全。下面仅以一个例子列举部分函数的部分用法。更多的函数和用法请仔细查阅Neural Network Toolbox的帮助文档。

例子：利用bp神经网络模型建立z=sin(x+y)的模型并检验效果

%第1步。随机生成200个采样点用于训练
x=unifrnd(-5,5,1,200);
y=unifrnd(-5,5,1,200);
z=sin(x+y);
%第2步。建立神经网络模型。其中参数一是输入数据的范围，参数二是各层神经元数量，参数三是各层传递函数类型。
N=newff([-5 5;-5 5],[5,5,1],'tansig','tansig','purelin');
%第3步。训练。这里用批训练函数train。也可用adapt函数进行增长训练。
N=train(N,[x;y],z);
%第4步。检验训练成果。
[X,Y]=meshgrid(linspace(-5,5));
Z=sim(N,[X(:),Y(:)]');
figure
mesh(X,Y,reshape(Z,100,100));
hold on;
plot3(x,y,z,'.') 参考技术A 不会，！！！ 参考技术B 我这里有源代码及注释，包括使用方法，留个邮箱吧，我发给你。