WGCNA相关重点

Posted 2023-02-28

参考技术A WGCNA定义，来源以及发展可阅读：https://wiki.mbalib.com/wiki/Scale_Free_Network

WGCNA无尺度网络是指在某一复杂的系统中，大部分节点只有少数几个连结，而某些节点却拥有与其他节点的大量连结。这些具有大量连结的节点称为“集散节点”，所拥有的连结可能高达数百、数千甚至数百万。这一特性说明该网络是无尺度的，因此，凡具有这一特性的网络都是无尺度网络。无尺度网络是指在某一复杂的系统中，大部分节点只有少数几个连结，而某些节点却拥有与其他节点的大量连结。这些具有大量连结的节点称为“集散节点”，所拥有的连结可能高达数百、数千甚至数百万。这一特性说明该网络是无尺度的，因此，凡具有这一特性的网络都是无尺度网络。

GCNA是加权基因共表达网络分析，旨在分析协同表达的基因模块，分析基因网络与疾病（表型）之间的关联，并找出网络中的核心基因。从方法讲，WGCNA分为表达量聚类分析和表型关联。主要包括基因相关系数的计算，基因模块的确定，共表达网络，模块与性状关联。

R-seq的根本目的是找到差异基因，而在数据归一化以后所进行的差异基因的寻找有两种：1 DEseq2差异分析；2 go ontology analysis

第一步 计算基因之间的相关系数   相关系数计算采用相关系数加权值，取相关系数的N次幂，这样使基因网络呈无尺度网络分布。而阈值的界定决定对相似基因表达的判定。

第二步  构建聚类树   根据相关系数进行分层聚类，而不同的分枝代表不同的基因模块，同一基因模块是表达相似的基因。将几万个基因按基因表达相关系数的N次幂分成几十个模块。这是信息归纳的过程。

重要含义

邻接矩阵   就是将顶点的基因和顶点之间的相关系数组成的矩阵称为邻接矩阵。一般邻接矩阵是具体数值，并不是由阈值设定的0/1矩阵。

topilogical matrix 

在邻接矩阵的基础上再计算一个邻接矩阵，TOM

WGCNA基本概念

理解WGCNA，需要先理解下面几个术语和它们在WGCNA中的定义。

共表达网络：定义为加权基因网络。点代表基因，边代表基因表达相关性。加权是指对相关性值进行冥次运算.(冥次的值也就是软阈值 (power, pickSoftThreshold这个函数所做的就是确定合适的power))。无向网络的边属性计算方式为abs(cor(genex, geney)) ^ power；有向网络的边属性计算方式为(1+cor(genex, geney)/2) ^ power; signhybrid的边属性计算方式为cor(genex, geney)^power if cor>0 else 0。这种处理方式强化了强相关，弱化了弱相关或负相关，使得相关性数值更符合无标度网络特征，更具有生物意义。如果没有合适的power，一般是由于部分样品与其它样品因为某种原因差别太大导致的，可根据具体问题移除部分样品或查看后面的经验值。

Module(模块)：高度内连的基因集。在无向网络中，模块内是高度相关的基因。在有向网络中，模块内是高度正相关的基因。把基因聚类成模块后，可以对每个模块进行三个层次的分析：1. 功能富集分析查看其功能特征是否与研究目的相符；2. 模块与性状进行关联分析，找出与关注性状相关度最高的模块；3. 模块与样本进行关联分析，找到样品特异高表达的模块。

基因富集相关文章 去东方，最好用的在线GO富集分析工具；GO、GSEA富集分析一网打进；GSEA富集分析-界面操作。其它关联后面都会提及。

Connectivity (连接度)：类似于网络中 "度"

(degree)的概念。每个基因的连接度是与其相连的基因的边属性之和。

Module eigengene E:

给定模型的第一主成分，代表整个模型的基因表达谱。这个是个很巧妙的梳理，我们之前讲过PCA分析的降维作用，之前主要是拿来做可视化，现在用到这个地方，很好的用一个向量代替了一个矩阵，方便后期计算。(降维除了PCA，还可以看看tSNE)  （补充：设法将原来变量重新组合成一组新的互相无关的几个综合变量，同时根据实际需要从中可以取出几个较少的综合变量尽可能多地反映原来变量的信息的统计方法叫做主成分分析或称主分量分析，也是数学上用来降维的一种方法。）

Intramodular connectivity:

给定基因与给定模型内其他基因的关联度，判断基因所属关系。

Module membership: 给定基因表达谱与给定模型的eigengene的相关性。

Hub gene: 关键基因 (连接度最多或连接多个模块的基因)。

Adjacency matrix

(邻接矩阵)：基因和基因之间的加权相关性值构成的矩阵。

TOM (Topological overlap

matrix)：把邻接矩阵转换为拓扑重叠矩阵，以降低噪音和假相关，获得的新距离矩阵，这个信息可拿来构建网络或绘制TOM图。

基本分析流程

image

构建基因共表达网络：使用加权的表达相关性。

识别基因集：基于加权相关性，进行层级聚类分析，并根据设定标准切分聚类结果，获得不同的基因模块，用聚类树的分枝和不同颜色表示。

如果有表型信息，计算基因模块与表型的相关性，鉴定性状相关的模块。

研究模型之间的关系，从系统层面查看不同模型的互作网络。

从关键模型中选择感兴趣的驱动基因，或根据模型中已知基因的功能推测未知基因的功能。

导出TOM矩阵，绘制相关性图。

WGCNA包实战

R包WGCNA是用于计算各种加权关联分析的功能集合，可用于网络构建，基因筛选，基因簇鉴定，拓扑特征计算，数据模拟和可视化等。

输入数据和参数选择

WGCNA本质是基于相关系数的网络分析方法，适用于多样品数据模式，一般要求样本数多于15个。样本数多于20时效果更好，样本越多，结果越稳定。

基因表达矩阵:

常规表达矩阵即可，即基因在行，样品在列，进入分析前做一个转置。RPKM、FPKM或其它标准化方法影响不大，推荐使用Deseq2的varianceStabilizingTransformation或log2(x+1)对标准化后的数据做个转换。如果数据来自不同的批次，需要先移除批次效应

(记得上次转录组培训课讲过如何操作)。如果数据存在系统偏移，需要做下quantile normalization。

性状矩阵：用于关联分析的性状必须是数值型特征

(如下面示例中的Height, Weight,

Diameter)。如果是区域或分类变量，需要转换为0-1矩阵的形式(1表示属于此组或有此属性，0表示不属于此组或无此属性，如样品分组信息WT,

KO, OE)。

链接：https://www.jianshu.com/p/e9cc3f43441d

下游分析：

得到模块以后进行  模块功能富集   计算基因模块与表型的关系   计算基因与样本的关系    

关键挖掘：分析核心基因    利用关系预测基因功能。

实操步骤：

1  数据准备是最复杂的，如果是芯片数据 直接归一化矩阵即可，而如果是RNAseq数据，那么用RPKM或者TPM都可以，然后就是样本的属性方面信息。

材料准备：需要将正常组织的数据剔除。

2  一般聚类用的是hcust