2019-10-22 R语言Seurat包下游分析-1

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篇首语:本文由小常识网(cha138.com)小编为大家整理,主要介绍了2019-10-22 R语言Seurat包下游分析-1相关的知识,希望对你有一定的参考价值。

参考技术A 下游分析

cellranger count 计算的结果只能作为错略观测的结果,如果需要进一步分析聚类细胞,还需要进行下游分析,这里使用官方推荐 R 包(Seurat 3.0)

流程参考官方外周血分析标准流程( https://satijalab.org/seurat/v3.0/pbmc3k_tutorial.html

Rstudio操作过程:

## 安装seurat

install.packages('Seurat')

## 载入seurat包

library(dplyr)

library(Seurat)

## 读入pbmc数据(文件夹路径不能包含中文,注意“/“的方向不能错误,这里读取的是10x处理的文件,也可以处理其它矩阵文件,具体怎样操作现在还不知道,文件夹中的3个文件分别是:barcodes.tsv,genes.tsv,matrix.mtx,文件的名字不能错,否则读取不到)

pbmc.data <- Read10X(data.dir = "D:/pbmc3k_filtered_gene_bc_matrices/filtered_gene_bc_matrices/hg19/")

## 查看稀疏矩阵的维度,即基因数和细胞数

dim(pbmc.data)

pbmc.data[1:10,1:6]

## 创建Seurat对象与数据过滤,除去一些质量差的细胞(这里读取的是单细胞 count 结果中的矩阵目录;在对象生成的过程中,做了初步的过滤;留下所有在>=3 个细胞中表达的基因 min.cells = 3;留下所有检测到>=200 个基因的细胞 min.genes = 200。)

pbmc <- CreateSeuratObject(counts = pbmc.data, project = "pbmc3k", min.cells = 3, min.features = 200)

pbmc

##计算每个细胞的线粒体基因转录本数的百分比(%),使用[[ ]] 操作符存放到metadata中,mit-开头的为线粒体基因

pbmc[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(pbmc, pattern = "^MT-")

##展示基因及线粒体百分比(这里将其进行标记并统计其分布频率,"nFeature_RNA"为基因数,"nCount_RNA"为细胞数,"percent.mt"为线粒体占比)

VlnPlot(pbmc, features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "percent.mt"), ncol = 3)

plot1 <- FeatureScatter(pbmc, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "percent.mt")

plot2 <- FeatureScatter(pbmc, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "nFeature_RNA")

CombinePlots(plots = list(plot1, plot2))

## 过滤细胞:根据上面小提琴图中基因数"nFeature_RNA"和线粒体数"percent.mt",分别设置过滤参数,这里基因数 200-2500,线粒体百分比为小于 5%,保留gene数大于200小于2500的细胞;目的是去掉空GEMs和1个GEMs包含2个以上细胞的数据;而保留线粒体基因的转录本数低于5%的细胞,为了过滤掉死细胞等低质量的细胞数据。

pbmc <- subset(pbmc, subset = nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 2500 & percent.mt < 5)

## 表达量数据标准化,LogNormalize的算法:A = log( 1 + ( UMIA ÷ UMITotal ) × 10000

pbmc <- NormalizeData(pbmc, normalization.method = "LogNormalize", scale.factor = 10000)

#pbmc <- NormalizeData(pbmc) 或者用默认的

## 鉴定表达高变基因(2000个),用于下游分析,如PCA;

pbmc <- FindVariableFeatures(pbmc, selection.method = "vst", nfeatures = 2000)

## 提取表达量变化最高的10个基因;

top10 <- head(VariableFeatures(pbmc), 10)

top10

plot1 <- VariableFeaturePlot(pbmc)

plot2 <- LabelPoints(plot = plot1, points = top10)

CombinePlots(plots = list(plot1, plot2))

plot1<-VariableFeaturePlot(object=pbmc)

plot2<-LabelPoints(plot=plot1,points=top10,repel=TRUE)

CombinePlots(plots=list(plot1,plot2))

## PCA分析:

# PCA分析数据准备,使用ScaleData()进行数据归一化;默认只是标准化高变基因(2000个),速度更快,不影响PCA和分群,但影响热图的绘制。

#pbmc <- ScaleData(pbmc,vars.to.regress ="percent.mt")

## 而对所有基因进行标准化的方法如下:

all.genes <- rownames(pbmc)

pbmc <- ScaleData(pbmc, features = all.genes)

pbmc <- ScaleData(pbmc, vars.to.regress = "percent.mt")

## 线性降维(PCA),默认用高变基因集,但也可通过features参数自己指定;

pbmc <- RunPCA(pbmc, features = VariableFeatures(object = pbmc))

## 展示 pca 结果(最简单的方法)

DimPlot(object=pbmc,reduction="pca")

## 检查PCA分群结果, 这里只展示前5个PC,每个PC只显示5个基因;

print(pbmc[["pca"]], dims = 1:5, nfeatures = 5)

##PC_ 1 

##Positive:  RPS27, MALAT1, RPS6, RPS12, RPL13 

##Negative:  CSTA, FCN1, CST3, LYZ, LGALS2 

##PC_ 2 

##Positive:  NKG7, GZMA, CST7, KLRD1, CCL5 

##Negative:  RPL34, RPL32, RPL13, RPL39, LTB 

##PC_ 3 

##Positive:  MS4A1, CD79A, BANK1, IGHD, CD79B 

##Negative:  IL7R, RPL34, S100A12, VCAN, AIF1 

##PC_ 4 

##Positive:  RPS18, RPL39, RPS27, MALAT1, RPS8 

##Negative:  PPBP, PF4, GNG11, SDPR, TUBB1 

##PC_ 5 

##Positive:  PLD4, FCER1A, LILRA4, SERPINF1, LRRC26 

##Negative:  MS4A1, CD79A, LINC00926, IGHD, FCER2 

## 展示主成分基因分值

VizDimLoadings(pbmc, dims = 1:2, reduction = "pca")

## 绘制pca散点图

DimPlot(pbmc, reduction = "pca")

## 画第1个或15个主成分的热图;

DimHeatmap(pbmc, dims = 1, cells = 500, balanced = TRUE)

DimHeatmap(pbmc, dims = 1:15, cells = 500, balanced = TRUE)

## 确定数据集的分群个数

# 鉴定数据集的可用维度,方法1:Jackstraw置换检验算法;重复取样(原数据的1%),重跑PCA,鉴定p-value较小的PC;计算‘null distribution’(即零假设成立时)时的基因scores。虚线以上的为可用维度,也可以调整 dims 参数,画出所有 pca 查看。

#pbmc <- JackStraw(pbmc, num.replicate = 100)

#pbmc <- ScoreJackStraw(pbmc, dims = 1:20)

#JackStrawPlot(pbmc, dims = 1:15)

# 方法2:肘部图(碎石图),基于每个主成分对方差解释率的排名。

ElbowPlot(pbmc)

## 细胞聚类:分群个数这里选择10,建议尝试选择多个主成分个数做下游分析,对整体影响不大;在选择此参数时,建议选择偏高的数字(为了获取更多的稀有分群,“宁滥勿缺”);有些亚群很罕见,如果没有先验知识,很难将这种大小的数据集与背景噪声区分开来。

## 非线性降维(UMAP/tSNE)基于PCA空间中的欧氏距离计算nearest neighbor graph,优化任意两个细胞间的距离权重(输入上一步得到的PC维数) 。

pbmc <- FindNeighbors(pbmc, dims = 1:10)

## 接着优化模型,resolution参数决定下游聚类分析得到的分群数,对于3K左右的细胞,设为0.4-1.2 能得到较好的结果(官方说明);如果数据量增大,该参数也应该适当增大。

pbmc <- FindClusters(pbmc, resolution = 0.5)

## 使用Idents()函数可查看不同细胞的分群;

head(Idents(pbmc), 5)

## 结果:AAACCTGAGGTGCTAG    AAACCTGCAGGTCCAC    AAACCTGCATGGAATA AAACCTGCATGGTAGG      AAACCTGCATTGGCGC 

               1                3                0               10                2 

Levels: 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

## Seurat提供了几种非线性降维的方法进行数据可视化(在低维空间把相似的细胞聚在一起),比如UMAP和t-SNE,运行UMAP需要先安装'umap-learn'包,这里不做介绍,两种方法都可以使用,但不要混用,如果混用,后面的结算结果会将先前的聚类覆盖掉,只能保留一个。

## 这里采用基于TSNE的聚类方法。

pbmc <- RunTSNE(pbmc, dims = 1:10)

## 用DimPlot()函数绘制散点图,reduction = "tsne",指定绘制类型;如果不指定,默认先从搜索 umap,然后 tsne, 再然后 pca;也可以直接使用这3个函数PCAPlot()、TSNEPlot()、UMAPPlot(); cols,pt.size分别调整分组颜色和点的大小;

DimPlot(pbmc,reduction = "tsne",label = TRUE,pt.size = 1.5)

## 这里采用基于图论的聚类方法

pbmc<-RunUMAP(object=pbmc,dims=1:10)

DimPlot(object=pbmc,reduction="umap")

## 细胞周期归类

pbmc<- CellCycleScoring(object = pbmc, g2m.features = cc.genes$g2m.genes, s.features = cc.genes$s.genes)

head(x = pbmc@meta.data)

DimPlot(pbmc,reduction = "tsne",label = TRUE,group.by="Phase",pt.size = 1.5)

## 存储结果

saveRDS(pbmc, file = "D:/pbmc_tutorial.rds")

save(pbmc,file="D:/res0.5.Robj")

## 寻找cluster 1的marker

cluster1.markers <- FindMarkers(pbmc, ident.1 = 1, min.pct = 0.25)

head(cluster1.markers, n = 5)

## 结果:      p_val             avg_logFC        pct.1       pct.2        p_val_adj

MT-CO1  0.000000e+00    -0.6977083      0.985       0.996       0.000000e+00

RPS27  2.182766e-282     0.3076454       1.000       0.999        3.480202e-278

MT-CO3 2.146399e-274    -0.4866429      0.995       0.997       3.422218e-270

DUSP1  2.080878e-247    -1.7621662       0.376       0.745       3.317752e-243

RPL34  8.647733e-244     0.3367755        1.000       0.997       1.378795e-239

##寻找每一cluster的marker

pbmc.markers <- FindAllMarkers(pbmc, only.pos = TRUE, min.pct = 0.25, logfc.threshold = 0.25)

pbmc.markers %>% group_by(cluster) %>% top_n(n = 2, wt = avg_logFC)

# A tibble: 24 x 7

# Groups:   cluster [12]

       p_val avg_logFC pct.1 pct.2 p_val_adj cluster gene 

       <dbl>     <dbl> <dbl> <dbl>     <dbl> <fct>   <chr>

 1 2.29e-123     0.636 0.344 0.097 3.65e-119 0       CD8B 

 2 7.62e-113     0.487 0.632 0.305 1.22e-108 0       LEF1 

 3 2.04e- 74     0.483 0.562 0.328 3.25e- 70 1       LEF1 

 4 1.39e- 61     0.462 0.598 0.39  2.22e- 57 1       ITM2A

 5 0.            2.69  0.972 0.483 0.        2       GNLY 

 6 0.            2.40  0.964 0.164 0.        2       GZMB 

 7 1.31e-121     0.768 0.913 0.671 2.09e-117 3       JUNB 

 8 2.06e- 94     0.946 0.426 0.155 3.28e- 90 3       RGS1 

 9 2.05e-255     1.57  0.586 0.09  3.27e-251 4       GZMK 

10 2.94e-140     1.57  0.69  0.253 4.68e-136 4       KLRB1

# ... with 14 more rows

## 存储marker

write.table(pbmc.markers,file="D:/allmarker.txt")

## 各种绘图

## 绘制Marker 基因的tsne图

FeaturePlot(pbmc, features = c("MS4A1", "GNLY", "CD3E", "CD14", "FCER1A", "FCGR3A", "LYZ", "PPBP", "CD8A"),cols = c("gray", "red"))

## 绘制Marker 基因的小提琴图

VlnPlot(pbmc, features = c("MS4A1", "CD79A"))

VlnPlot(pbmc, features = c("NKG7", "PF4"), slot = "counts", log = TRUE)

## 绘制分cluster的热图

top10 <- pbmc.markers %>% group_by(cluster) %>% top_n(n = 10, wt = avg_logFC)

DoHeatmap(pbmc, features = top10$gene) + NoLegend()

剩下的便是寻找基因 marker 并对细胞类型进行注释(见下回分解)

将R环境下的Seurat RDS格式数据转化成为到python环境下scanpy的anndata格式

参考技术A

无论是单细胞、空间组还是ATAC的数据,有时由于下游分析的需求或可视化的需求,同时由于python的运算速度的优势,目前越来越多单细胞分析的工具开始在python环境下开发(scanpy/spGCN/scVelo……),但是大家大多都习惯了R的分析环境(Seurat/Harmony/Monocle3……),所以我们经常需要在不同的环境中运行同一个分析对象,这所以涉及到的数据类型的转变就非常关键了。

想直接想找工具将RDS转为python可读数据对象的包,目前还没有……(如果有大佬可以开发一下)。

目前所以从数据本身出发有三种方式,总结自目前网络上一些可行的方法:

1,提取矩阵(稀疏/稠密)和特征信息(metadata),手动构筑 anndata (单细胞分析时python中的一种数据结构,具体了解可以看一下: https://www.jianshu.com/p/9b057e105c42 ,写得挺好)就好。前提是对R的S4对象和python的anndata对象有基础的认识,就可以搞定,这是最本质也是最万能的方法,除了门槛高。

2,存储的时候就注意,不要保存成rds,或者已经这样保存了也无所谓,可以读入再重新存:
(1)存储成 h5ad格式 。Seurat数据写成h5需要借助包 SeuratDisk : https://github.com/mojaveazure/seurat-disk
从R环境下Seurat的对象保存成h5ad的格式:

然后用python的anndata包/scanpy包直接读入就好,因为h5ad本来就是单细胞在跑一python环境中分析最基础的格式,对标R中的seurat对象或sce对象

这个方法可以具体参考: https://www.jianshu.com/p/c438d545f696 他写得更加详细一点

(2)Seurat官方设置 loom格式 也是可行方式之一:
参见: https://www.jianshu.com/p/147da295fc34
将Seurat对象转为loom:

在python环境下读入loom,成为adata:

总而言之,经个人使用和实际操作来说, 第二个存储成为h5ad的方法时最好用的、也最友好 ,除了只能保存一个assay之外,就都没问题,但是如果许多保存多个assay成为anndata中的多个layer,这就的用手动的方法了。

以上是关于2019-10-22 R语言Seurat包下游分析-1的主要内容,如果未能解决你的问题,请参考以下文章

Seurat单细胞分析常见代码-02

单细胞转录组测序分析--初探Seurat

服务器安装新版本R及Seurat方法

找出cluster的差异基因并进行GO和KEGG分析

单细胞空间转录分析之Scanpy

Seurat | 单细胞分析工具