使用Ensembl查找基因启动子序列

Posted 2023-04-21

参考技术A ​Ensembl

http://www.ensembl.org/index.html

1.选择物种，搜索基因。

2.点击进入基因的summary页面。

3.点击左侧sequence，得到序列信息。

4.橘色背景红色字体序列为exon区域，第一个外显子前边的序列即为promoter序列，默认设置为600bp。        

5.若想获取更长的promoter序列，点击左侧“Configure this page”重新配置。

6.修改5' Flanking sequence (upstream)，例如修改为1000，保存并关闭，即可得到更新后1000bp的promoter序列。

7.在UCSC中核实（Ensembl和UCSC注释之间就TSS的识别可能存在差异）。复制启动子序列，在UCSC进行blat，点击第一条的browser进入基因组浏览界面，zoom out 3X，查看页面确保启动子序列符合UCSC注释（输入的序列在目标基因的第一个exon之前，序列区域内有CpG岛）。

kaks calculator批量计算多个基因的选择压力kaks值

欢迎来到"bio生物信息"的世界

今天给大家带来“批量计算kaks值”的技能。

关于kaks的背景知识我就不介绍了，感兴趣的自行搜索，这里直接开始讲怎么批量计算kaks值。

1 文件准备

首先准备两个文件，一个是基因的cds序列，一个是蛋白质序列。

cds序列和蛋白质可以在ensembl网站找到：http://ftp.ensembl.org/pub/current_fasta/

这两个文件的示例如下：

cds序列文件cds.fa

>gene1
ATGGAGGTTGCAATGGTGAGTGCGGAGAGCTCAGGATGCAACAGTCACATGCCTTACGGT
TATGCTGCCCAGGCCCGGGCCCGGGAGCGGGAGAGGCTTGCTCACTCCAGGGCAGCTGCG
GCAGCTGCCGTTGCAGCGGCCACAGCTGCCGTCGAAGGAAGTGGGGGTTCTGGTGGGGGG

>gene2
ATGGAGGTTGCAATGGTGAGTGCGGAGAGCTCAGGGTGCAACAGTCACATGCCTTATGGT
TATGCTGCCCAGGCCCGGGCCCGGGAGCGGGAGAGGCTTGCTCACTCCAGGGCAGCTGCA
GCAGCTGCTGTTGCAGCGGCCACAGCTGCTGTCGAAGGTAGCGGGGGTTCTGGTGGGGGC
TCCCAC

>gene3
ATGGAGGTGGCGATGGTGAGTGCGGAGAGCTCAGGGTGCAACAGTCACATGCCTTACGGG
TACGCGGCCCAGGCCCGGGCCCGGGAGCGGGAGAGGCTGGCTCACTCCCGGGCGGCGGCG
GCCGCCGCCGTCGCGGCTGCCACGGCTGCCGTGGAAGGCAGTGGGGGGCCTGG

蛋白质序列pep.fa

>gene1
MEVAMVSAESSGCNSHMPYGYAAQARARERERLAHSRAAAAAAVAAATAAVEGSGGSGGG

>gene2
MEVAMVSAESSRCNSHMPYGYAAQARARERERLAHSRAAAAAAVAAATAAVEGSGSSGGGSH

>gene3
MEVAMVSAESSGCNSHMPYGYAAQARARERERLAHSRAAAAAAVAAAKAAVEGSGGP

注意：cds.fa和pep.fa文件的序列ID号（gene1,2,3）要一致。

2 对蛋白质序列pep.fa进行比对

进行蛋白质序列比对前，需要先安装mafft软件。

下载mafft软件：

wget https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/mafft-7.453-with-extensions-src.tgz

tar -zxvf mafft-7.453-with-extensions-src.tgz

cd mafft-7.453-with-extensions/core

安装：

1）有root权限用户安装法：

make clean

make

su

make install

2）无root权限用户安装法：

vi Makefile

进入makefile文件后，修改第一行和第三行，如下所示两张图，分别为修改前和修改后（请务必修改你有权限的路径）：

安装成功后，输入命令mafft --auto pep.fa > alig_pep.fa

生成的alig_pep.fa文件如下：

3 将比对好的蛋白质序列与cds序列比对

这一步需要下载pal2nal.pl文件

wget http://www.bork.embl.de/pal2nal/distribution/pal2nal.v14.tar.gz

tar -zxvf pal2nal.v14.tar.gz

cd pal2nal.v14/

下载后就能看见pal2nal.pl这个文件

随后将蛋白质序列与cds序列比对

pal2nal.pl alig_pep.fa cds.fa -output fasta > cds_pep_aln.fa

比对好的cds_pep_aln.fa文件如下所示：

4 生成计算kaks值时的基因对

计算kaks值前需要先将cds_pep_aln.fa文件拆分：

csplit cds_pep_aln.fa />/ -n2 -s {*} -f gene -b "%1d.fa" ; rm gene0.fa

拆分后，会生成gene1.fa 、gene2.fa、 gene3.fa三个文件。

接下来，将生成的gene1.fa、 gene2.fa、 gene3.fa组成新的基因对gene1-gene2、gene1-gene3、gene2-gene3，见如下命令：

for i in $(seq 1 3)

do

cat gene1.fa gene${i}.fa > gene1_${i}.fa

done

cat gene2.fa gene3.fa > gene2_3.fa

生成如下几个文件：

gene1_1.fa

gene1_2.fa

gene1_3.fa

gene2_3.fa

其中，gene1_2.fa、gene1_3.fa、gene2_3.fa为我们所需的基因对。

这里将他们提取成基因对，而不是多条序列进行计算的原因是，KaKs_Calculator这个软件在处理多序列的输入文件时，会报错：Error. The size of two sequences in ‘gene1&gene2‘ is not equal。我尝试了很多遍，发现只能提取成基因对才不会报这种错误。当然，偶尔运气好的时候，KaKs_Calculator是能处理多序列的kaks值的，为了防止出错，我们还是将他们拆开计算好一点。

5 将gene1_2.fa、gene1_3.fa、gene2_3.fa文件转化为axt文件

转化为axt文件需要下载parseFastaIntoAXT.pl文件，文件地址：https://gitee.com/liaochenlanruo/kaks_pupline/blob/master/parseFastaIntoAXT.pl

下载后，输入如下命令:

for i in *.fa

do

echo $i

perl parseFastaIntoAXT.pl $i

done

生成三个文件：

gene1_2.fa.axt

gene1_3.fa.axt

gene2_3.fa.axt

6 计算kaks值

下载安装kakscalculator

下载链接：https://sourceforge.net/projects/kakscalculator2/

输入以下命令：

for i in *.fa.axt

do

echo $i

KaKs_Calculator -i $i -o ${i%%.*}.kaks

done

生成三个文件：gene1_2.kaks、gene1_3.kaks、gene2_3.kaks

到这一步，批量计算kaks值的工作就已经搞定。

这里附上安装kaks_calculator软件可能会遇到报错：
g++ -O -o AXTConvertor AXTConvertor.cpp -lstdc++ -lm
AXTConvertor.cpp: In function ?.ool readPhylip()?.
AXTConvertor.cpp:210:22: error: ?.toi?.was not declared in this scope
if (atoi(num.c_str())!=sequence.size()){

AXTConvertor.cpp: In function ?.ool readNexus()?.
AXTConvertor.cpp:338:39: error: ?.toi?.was not declared in this scope
if (sequence.size()!=atoi(num.c_str())) >{
make: *** [AXTConvertor] Error 1

解决方法在这里：

编辑KaKs.cpp文件，加上include "string.h"

编辑AXTConvertor.cpp文件，加上include "stdlib.h"

编辑GY94.cpp文件，加上 include "string.h"

如无报错请忽略上述内容。