转录组测序3-序列基因组比对

Posted 2023-05-05

参考技术A 转录组测序是最常用的组学实验，对全谱基因定量，找到差异表达基因。RNAseq涉及到原始数据，数据质控，基因组比对，差异基因鉴定，差异基因功能富集分析，重要基因如转录因子激酶的靶基因预测等，我们用10讲的时间，全面讲解转录组测序报告，及在上百个项目中遇到的近百个常见问题。

前两期视频，我们讨论了 测序原始数据 ， 原始数据的质控和过滤 。我们拿到cleandata数据，在分析样品的基因表达信息前需要做基因组比对，序列注释。如何对序列进行比对、注释；比对率多少算是合格的测序数据呢，如何查看比对结果？本期视频继续探讨。

（1）转录组测序如何进行基因组比对，原理是什么；

（2）有参考基因组和无参考基因组的分析区别在哪里，怎样选择分析模式；

（3）转录组序列比对的工具有哪些；

（4）基因组比对结果BAM/SAM文件格式简介，以及比对率统计；

（5）基因组浏览器IGV的安装和使用，查看基因组比对概况、基因外显子表达量、可变剪切以及基因组变异位点的教学演示。

视频教程：

bilibili超清视频链接： https://www.bilibili.com/video/BV1ZJ41177rQ

转录组入门：序列比对

任务列表

• 比对软件
• hisat2的用法
• 下载index文件
• 比对、排序、索引
• 质量控制
• 载入IGV，截图几个基因

hisat2的用法

本作业是比对到基因组，所以使用gapped or splices mapper，此流程已经更新。TopHat首次被发表已经是7年前，STAR的比对速度是TopHat的50倍，HISAT更是STAR的1.2倍。HISAT2是TopHat2/Bowti2的继任者，使用改进的BWT算法，实现了更快的速度和更少的资源占用，作者推荐TopHat2/Bowti2和HISAT的用户转换到HISAT2。

官网：https://ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml（学习一个软件最好的方法就是结合现有中文资料，加上阅读官方说明书和HELP文档，一般刚开始学习的时候先使用默认参数，不要乱调参数）

下载index文件

cd ~/reference
mkdir -p index/hisat && cd index/hisat
wget -c ftp://ftp.ccb.jhu.edu/pub/infphilo/hisat2/data/hg19.tar.gz
wget -c ftp://ftp.ccb.jhu.edu/pub/infphilo/hisat2/data/mm10.tar.gz
tar zxvf hg19.tar.gz
tar xvzf mm10.tar.gz

-c：断点续传

比对、排序、索引

把fastq格式的reads比对上去得到sam文件，接着用samtools把它转为bam文件，并且排序（注意N和P两种排序区别）索引好（可以使用管道实现，省去中间SAM保存的过程，直接输出BAM文件）

编写bash脚本：map.sh

#! usr/bin/bash
set -u
set -e
set -o pipefail
hg19_ref=/mnt/hgfs/2017/reference/index/hisat/hg19/genome
mm10_ref=/mnt/hgfs/2017/reference/index/hisat/mm10/genome
data_path=/mnt/hgfs/2017/rna_seq/data
NUM_THREADS=25
ls --color=never Homo*1.fastq.gz | while read id;do(~/biosoft/hisat2-2.1.0/hisat2 -t -p $NUM_THREADS -x $hg19_ref -1 $data_path/${id%_*}_1.fastq.gz -2 $data_path/${id%_*}_2.fastq.gz 2 > ${id%_*}_map.log | samtools view -Sb  - > ${id%_*}.bam);done
ls --color=never Mus*1.fastq.gz | while read id;do(~/biosoft/hisat2-2.1.0/hisat2 -t -p $NUM_THREADS -x $mm10_ref -1 $data_path/${id%_*}_1.fastq.gz -2 $data_path/${id%_*}_2.fastq.gz 2 > ${id%_*}_map.log | samtools view -Sb  - > ${id%_*}.bam);done
ls --color=never *.bam | while read id;do(samtools sort --threads $NUM_THREADS $id -o ${id%.*}_sorted.bam);done
ls --color=never *_sorted.bam | while read id;do(samtools index $id);done

运行脚本： 

bash map.sh

质量控制

对bam文件进行简单QC

Reads比对后的质量控制(评估比对质量的指标)

比对上的reads占总reads的百分比；

Reads比对到外显子和参考链上的覆盖度是否一致；

比对到基因组序列，多重比对reads；

相关质控软件除了Picard，RSeQC，Qualimap还有一大堆