从零开始学测序——转录组1

Posted 2023-05-07

参考技术A 1. HGP时期低通量RNA序列研究方法

• Sanger测序

▷Gene clone

▷Full-length mRNA

▷dbEST/Unigene database

• Microarray技术

▷Tiling array: 瓦片层叠芯片

2. 高通量测序时代

• DNA测序：全基因组de novo测序；全基因组重测序；宏基因组测序；人类外显子组捕获测序等

• RNA测序：转录组测序；小RNA测序；非编码RNA测序（不带polyA的RNA测序）

PS：rRNA去除的RNA测序，测到的是mRNA和所有非编码RNA

• 表观基因组研究：ChIP-Seq；DNA甲基化测序

3. 非编码RNAs (ncRNAs)

指不被翻译成蛋白质的RNA，以RNA分子的形式完成其生物学功能的RNA。

目前对ncRNAs种类的界定没有同意的说法，可按功能、长度、细胞定位等具有不同的分类，其中，按功能分主要有以下两类：管家ncRNAs (house keeping ncRNAs)，包括tRNAs, rRNAs, snRNAs, snoRNAs, SRPRNA；另一类为调节ncRNAs (regulatory ncRNAs)

4. 长非编码RNAs (lncRNAs)

指的是长度大于200nt的功能RNA分子。其中有一类是带polyA，另一类不带polyA，前者的特征和mRNA类似，比如：也被RNA polymerase II转录，具有polyA信号，加帽，可被剪接等；后者没有polyA tail的lncRNAs也有剪接现象。

lncRNAs的特性：在序列上不保守，且表达量低，组织特异性强，通常与蛋白编码基因协同表达，共同参与众多生物过程。

lncRNAs的功能：主要调节蛋白编码基因的表达、稳定性及亚细胞定位，包括基因印迹的控制，X染色体的补偿，应激反应，免疫反应，细胞的分化和发育，疾病、肿瘤等，eg, 哺乳类Xist基因编码的ncRNA可使雌性两条X染色体中随机失活1条，达到剂量补偿的目的。

5. lncRNAs: Genomics, Functions, Methodologies, Modes of Actions

(1) RNA生物学研究历史

(2) ENCODE计划

ENCODE计划是HGP之后美国政府启动的来揭示人类基因组中每段DNA的功能，尝试读懂人类遗传密码。(http://www.gencodegenes.org/)

(3) Forms of lncRNAs

Major forms: lincRNA, Enhancer RNA, antisen-lincRNA

Other forms of lncRNAs: sno-lncRNA（在lncRNA的两端有一些snoRNA来保护）, Circular RNA（无polyA尾，头尾连接形成环形RNA，可能来源于intron剪切，也有可能是两个外显子的连接）

(4) In Cis - or Trans-

可把lncRNAs的功能大致分为两类，一类被转录出来之后就近发挥作用，直接调控旁边基因的表达，被称为function in cis-. eg, HOTTIP这个lncRNA，调控附近基因组区域的组蛋白甲基化修饰状态；女性中转录了Xist lincRNAs的那条X染色体失活。另一类lncRNA被转录出来后并不在转录位点附近发挥作用，而是到远端发挥作用，被称为Trans-acting lncRNAs。

(5) 特征

Low abundance (低表达量)，Tissue-specificity (组织表达特异性强，只在一种或少数几种组织中表达)

(6) Several well-characrerized lncRNA with detailed molecular mechanisms

(7) Four principles of nucleic acid and protein interactions

RNA-Protein, DNA-RNA, Protein-DNA, RNA-RNA 

RNA-seq转录组名词解释基础

参考技术A 2019年7月24日，Nature Reviews Genetics上发表了一篇了RNA-seq的综述，文献信息如下所示：

Stark, R., et al. (2019). "RNA sequencing: the teenage years." Nature Reviews Genetics.

摘要：在过去的十年中，RNA测序(RNA-seq)已经成为在全转录组范围内分析差异基因表达和mRNAs差异剪接的重要工具。然而，随着下一代测序技术的发展，RNA-seq技术也在不断发展。现在，RNA-seq用于研究RNA生物学的许多方面，其中包括单细胞基因表达、翻译(翻译组,translatome)和RNA结构(结构体，structurome)。其它的应用也在开发中，例如 空间转录学(Spatialomics)。加上新的长片段 (long-read)和直接RNA-seq技术以及用于数据分析的更好的计算工具的整合，RNA-seq技术的创新有助于人们更全面地理解RNA生物学，例如从何时何地转录发生到控制RNA功能的折叠和分子间相互作用等问题。

这篇综述信息密度很高，先把文献旁边的名词解释给译了一下，如下所示：

1. 差异基因表达： Differential gene expression, 即DGE，一种分析方法，目标是使研究者们找出不同实验组之间的变化的基因。

2. 读长深度：Read depth， 一个样本测序后所获得的 所有测序读长( reads)， 注意与测试深度进行区分。

3. 短读长：short-read： 一种测序技术，产生的读长(read)的长度为500bp，但更常见的是100-300bp，它测的是打断后的mRNA。

4. 长读长：long-read， 一种测序技术，能够没到1000bp，它代表的全长或接近全长的mRNA。

5. 直接RNA测序： Direct RNA sequencing,dRNA-seq，一种测序技术， 在不用打断RNA以及反转录的情况下，对RNA进行直接测序 ，其目标通常是为了检测全长或接近全长的RNAs。

6. 多重回贴读长 ：multi-mapped reads：来源于转录组的同源区（homologous region）的测序读长，这些读长无法明确地回贴到基因组上或转录组上。

7. 合成长读长： synthetic long reads:一种方法，能够通过组装来对多个短读长进行合成，生长长读长。

8. 唯一分子标签： Unique molecular identifiers， UMIs ，一种短的序列或编码标签(barcodes)，这些短序列通常会 在RNA-seq文库制备过程中进行添加（在进行PCR之前） ，这种序列能够对一个特定的起始分子进行标记。此方法通用用于 校正RNA-seq数据的定量偏差， 在少量RNA进行测序或单细胞测序中使用尤为广泛。

9 。读长长度：read length：每个 测序读长的长度，在短读长RNA测序过程中，这个长度通常是50-150bp。

10. 灵敏度： Sensitivity，一种指标，它表示在每个样本中，能够 检测到转录本的比例 。样本处理，文库制备，测序以及数据分析都会影响这个指标。

11. 特异性：specificity:  一种检测指标，它表示的是 差异表达的转录本在检测到的转录本中的比例 。样本处理，文库制备，测序和数据分析都会影响这个指标。

12. 标签读长：Tag read，  对于一个转录本来说，一个标签读长是唯一，它通常来源于mRNA的3‘末端，这种读长用于分析差异表达转录本，或者是来源于5'端，这种通常用于分析转录起始位点和启动子。

13. 重复率：duplication rates，  在一个RNA测序样本中， 回贴到转录本上同一位置的测序读长的比例。 在RNA-seq文库中，对于一些转录本来说， 重复率是比较高的，这是因为它们在样本中的的表达水平比较高，同时低表达的转录本，重复率很低。

在RNA-seq中，重复率是一个重要问题，因为多数情况下，重复的读长或许代了真正高表达的转录本，而一些重复读长则是有可能来源于测序偏倚。所以，要加以判断！！

14:单端测序： single-end squencing，只测cDNA片段的一端的短读长测序手段，它通常用于基因表达分析实验，优势就是便宜。

15. 双端测序： paired-end sequencing,同时测cDNA片段的两端短读长测序手段，通常用于基因表达分析实验，如果是要研究剪接，则需要最大的灵敏度，因为每个cDNA的更多碱基会被检测到。

16. 生物学重复： Biological replicates：同时检测生物学意义上的不同样本，例如来源于 不同的3个研究对象的组织 ，生物学重复可以发现生物学偏差，这要么代表了自身的一种研究駨，要么代表了噪音。相比之下，

技术重复 则是： 对同一个样本进行重复的要检测 ，例如同一个组织检测3次，检查是否是因为实验技术导致的偏差。

17. 表达矩阵：Expression matrix， RNA-seq中差异表达基因的数值矩阵。行代表RNA特征，例如基因名或转录本名，列表示测序样本。这些值通常用与每个RNA特征相关在的读长数目表示，表达矩阵可以用于估计异构体特征，在进行下游分析之前， 通常要经过归一化处理(normalization)。

18. 外参控制(spike-in control) ，处理样本之前，spink-in ,将已知浓度的外源核酸混合物添加到一个样本中。它们通常是各种浓度的人工合成的RNA序列，会被提前混合，用于 监测反应效率 ，并确定方法学的偏倚处理以及用于监测假阴性。

19. 空间转录组学， Spatialomics， 一种转录组分析方法，它能保留一个样本中每个转录本的 空间信息，例如一个组织的不同区域。

20. 初始RNA ，Nascent RNA，刚开始被转录的RNA，这些RNA与那些已经被处理后，输送到细胞质的RNA不同。

21. 4-硫尿核苷， 4-Thiouridine， 4 sU，含有一个硫原子的核苷，通常不并存在于真核生物的mRNA中，它很容易整合进核酸中，用于初始RNA分析。

22. 翻译组：Translatome ，一个细胞，组织或机体中，所有 从mRNA翻译到蛋白质 的总和。

23. 结构组：Structurome, 一个细胞，组织或机体中，所有 二级和三级结构的RNA 总和。

24. 相互作用组： Interactome，一个细胞，组织或机体中，所有 分子之间相互作用 的总和，包括RNA-RNA，RNA-蛋白质之间的相互作用。