高效液相色谱法HPLC和液质联用LC-MS在蛋白质/多肽混合物分析中的应用

Posted 2020-12-10 xixilichuanshuo

高效液相色谱法HPLC是分析蛋白质/多肽混合物中应用最广泛的一种分析法。在完整蛋白质的分离中，固定相和分离模式的多样性赋予了HPLC相当大的分辨率。HPLC分离模式的组合是蛋白质组学分析最有效的工具之一。串联组合分离模式的使用被称为“串联高效液相色谱法”。串联液相色谱法的目的在于利用不同的分离模式组合，提高肽在混合物中的分辨率。HPLC的主要模式和分离的特征：

 

•RP：疏水性

•强阳离子交换：净正电荷

•强阴离子交换：净负电荷

•体积排阻：肽大小/分子量

•亲和力：与特定功官能团的互动

 

这里列出的分离模式中，除了体积排阻之外，所有模式都可能有利于对蛋白质/多肽进行分离，体积排阻介质的分辨率不足以分离出蛋白质水解所产生的分子量范围内的多肽片段。

 

John Yates等人曾经利用串联LC-MS有效地分析了复杂的蛋白质/多肽混合物。他们在过程中使用到了串联毛细管柱，直接洗脱到质谱仪中（图1）。此方法称为 “MudPIT”（多维蛋白质鉴定技术）。MudPIT首先将多肽上到强阳离子交换（SCX）柱，该柱充当系统的“前端”。多肽以亲合性吸附到SCX柱上，亲合性与每个肽上的总正电荷数（例如，电离氮）成正比。通过增加盐浓度的梯度洗脱多肽。每一步都会释放出一组多肽，然后通过位于SCX柱下游的反相色谱柱。再通过反相高效液相色谱梯度分离每个肽基，该梯度根据肽的疏水性分解肽基。多肽片段经过RP柱直接进入质谱仪进行分析。完成RP梯度后，盐梯度在下一步中从SCX柱释放更多的肽，然后在进入MS之前由RP柱进一步分解。继续此循环，直到所有肽从SCX柱洗脱。

 

图1. 串联离子交换(SCX)-RP-HPLC系统原理图

 

本文由百泰派克生物科技整理编辑，未经许可，不得转载。

 

北京百泰派克生物科技采用高分辨率质谱平台技术，包括Thermo Fisher的Q Exactive质谱仪，LTQ Orbitrap Velos质谱仪，以及AB SCIEX的6500 Q TRAP质谱仪，结合 Nano-LC高通量液相色谱技术，能够对SDS-PAGE蛋白条带、2D蛋白胶点等样品中的蛋白质进行高效精准鉴定。胶条、胶点蛋白质谱鉴定服务可保证100%的鉴定率。