重磅干货(二)：关于外显子测序的那些疑问

Posted 2023-05-07

参考技术A

外显子组（Exome）是一个物种基因组中全部外显子区域的总和，是遗传物质中编码蛋白质的DNA序列，占整个基因组的1%-2%。外显子组分析有助检测出和疾病相关的编码区突变，从而研究DNA变异对正常生物学机制与疾病发病机制的影响。

外显子测序已经在多种单基因遗传病研究、多基因遗传病研究、肿瘤研究及产前诊断中得到了应用。实验方面作为其中重要的一个环节，对数据以及后续的分析有着极为关键的影响，对此我们特邀实验专家给大家讲讲那些实验上的事儿~

外显子测序目前常用的平台之一为Agilent SureSelect Human All Exon V6捕获平台，该平台捕获率高，基本可达到70%以上。 如果出现捕获特异性低于70%，从实验环节考虑，有可能是以下几个方面导致：
（1）插入片段偏大，文库之间部分杂交，导致含有部分非目的片段的序列被捕获。外显子平均长度160bp，文库最好在200-500bp，使得目标外显子序列覆盖范围大，邻近内含子区域测序最少。
（2）杂交投入量过高，影响捕获的最佳动力学状态，同时也会影响封闭的效率。
（3）杂交和洗杂交的操作严谨性，合适的盐浓度和漂洗温度可保证获得稳定的捕获效率。

目前评价覆盖均一度的指标主要有Fold80，或不同深度下的覆盖率。 影响覆盖均一度的因素主要有以下几点：
1. 芯片设计
不同厂家的芯片设计原理不同，芯片设计的均一性直接影响目标区域的覆盖均一度指标。可通过标准品测试不同厂家芯片的覆盖度均一性。
2. 样本质量
a.样本完整度，ffpe样本大多存在降解，血液和新鲜组织样本完整度会较高。b.样本纯度，主要看是否有RNA、蛋白质、糖分的污染。c.样本总量，我们对于建库的DNA起始投入量是有要求的，一般200ng。血液和新鲜组织提取出的DNA量通常情况下都足够。
3. PCR效率
PCR效率可能会改变不同区域文库的比例，但是通常这部分影响不大，只有当文库发生极为显著的不均一扩增时，才会影响覆盖度和均一性。

近期我们会不定期推出各类产品常见问题，希望能帮助大家解决各种疑难杂症，请大家拭目以待！

如何对比两个基因外显子

1、可以比较它们的序列，从而确定它们的相似性和差异性。可以做序列比对，对比两个外显子序列之间的相似度，然后比较它们的编码区域，以及外显子之间的编码氨基酸的相似性和差异性。
2、可以比较它们的结构，看它们的长度、起始点及终止点，以及它们的5’端和3’端。
3、可以比较它们的转录和翻译机制，看它们的剪接特征，以及各种转录因子及其结合位点的分布。
4、可以比较它们的功能，看它们是否具有类似的功能，或者是否有同源性或变异性，以及它们在特定细胞类型中的表达水平。 参考技术A 对比两个基因外显子可以使用系统发生学方法，如序列比对和树形比较。首先，将两个基因外显子的DNA序列进行比对，找出它们之间的相似和不同之处，然后利用这些信息构建一棵进化树，以便进一步深入了解两个基因外显子间的差异。 参考技术B 1、首先输入基因的完整学名,找到与基因相关的cDNA序列.在这一cRNA序列的解说信息里,就已经有各外显子的分节.
2、将该cDNA输入Blast进行序列比对,就可以找到其每一个外显子所对应的染色体位置,这些信息就显示了所有的外显子.处于外显子两端的序列就是内含子.
3、如你需要完整的基因序列,需要在blast中选择others这个数据库,然后查找相关的Bac质粒中含有你完整基因的文件,在其中找到你所需的信息.