差异基因显著阈值log2fc的绝对值怎么算

Posted 2023-04-18

log2FC中的FC即 fold change，表示两样品（组）间表达量的比值，对其取以2为底的对数之后即为log2FC。一般默认取log2FC绝对值大于1为差异基因的筛选标准；
FDR即False Discovery Rate，错误发现率，是通过对差异显著性p值（p-value）进行校正得到的。由于转录组测序的差异表达分析是对大量的基因表达值进行独立的统计假设检验，会存在假阳性问题，因此在进行差异表达分析过程中，采用了公认的Benjamini-Hochberg校正方法对原有假设检验得到的显著性p值（p-value）进行校正，并最终采用FDR作为差异表达基因筛选的关键指标。一般取FDR<0.01或者0.05作为默认标准。
这两个指标的选取一般是按照经验值去筛选的，并非完全不可以调整。在实验差异基因数目过低或者过高，可以对指标进行微调。
实际上经常看到的差异表达火山图（如下图）里的几条虚线就是这两个指标的体现。
为什么要用FDR
在转录组分析中，如何确定某个转录本在不同的样品中表达量是否有差异是分析的核心内容之一。一般来说，我们认为，不同样品中，表达量差异在两倍以上的转录本，是具有表达差异的转录本。为了判断两个样品之间的表达量差异究竟是由于各种误差导致的还是本质差异，我们需要根据所有基因在这两个样本中的表达量数据进行假设检验。常用的假设检验方法有t-检验、卡方检验等。很多刚接触转录组分析的人可能会有这样一个疑问，一个转录本是不是差异表达，做完假设检验看P-value不就可以了么？为什么会有FDR这样一个新的概念出现？这是因为转录组分析并不是针对一个或几个转录本进行分析，转录组分析的是一个样品中所转录表达的所有转录本。所以，一个样品当中有多少转录本，就需要对多少转录本进行假设检验。这会导致一个很严重的问题，在单次假设检验中较低的假阳性比例会累积到一个非常惊人的程度。举个不太严谨的例子。
假设现在有这样一个项目：
● 包含两个样品，共得到10000条转录本的表达量数据，
● 其中有100条转录本的表达量在两个样品中是有差异的。
● 针对单个基因的差异表达分析有1%的假阳性。
由于存在1%假阳性的结果，在我们分析完这10000个基因后，我们会得到100个假阳性导致的错误结果，加上100条真实存在的结果，共计200个结果。在这个例子中，一次分析得到的200个差异表达基因中，有50%都是假阳性导致的错误结果，这显然是不可接受的。为了解决这个问题，FDR这个概念被引入，以控制最终得到的分析结果中假阳性的比例。
如何计算FDR
FDR的计算是根据假设检验的P-value进行校正而得到的。一般来说，FDR的计算采用Benjamini-Hochberg方法（简称BH法），计算方法如下：
1. 将所有P-value升序排列.P-value记为P，P-value的序号记为i，P-value的总数记为m
2. FDR(i)=P(i)*m/i
3. 根据i的取值从大到小，依次执行FDR(i)=minFDR(i),FDR(i+1)
注：实际上，BH法的原始算法是找到一个最大的i，满足P≤i/m*FDR阈值，此时，所有小于i的数据就都可以认为是显著的。在实践中，为了能够在比较方便的用不同的FDR阈值对数据进行分析，采用了步骤3里的方法。这个方法可以保证，不论FDR阈值选择多少，都可以直接根据FDR的数值来直接找到所有显著的数据。 参考技术A 一般默认取log2FC绝对值大于1为差异基因的筛选标准（即差异两倍以上的视为差异基因） 参考技术B log2FC中的FC即 fold change，表示两组样品间表达量的比值，对其取以2为底的对数之后即为log2FC。一般默认取log2FC绝对值大于1为差异基因的筛选标准（即差异两倍以上的视为差异基因）。
我们画火山图，只需要其中的log2FC和FDR就可以了。在绘图之前，我们需要对FDR进行转换，将它的值变成-log10，如果有0，会产生Inf，需要去除。这样的话可以拉开差异表达基因之间的间距。在纵坐标上才可以很好的显示出来。上面的数据已经处理了。后面只需要取相应的列就行。

差异表达基因分析：差异倍数(fold change), 差异的显著性(P-value)

参考技术A Differential gene expression analysis：差异表达基因分析

Differentially expressed gene (DEG)：差异表达基因

差异表达分析是目前比较常用的识别疾病相关miRNA以及基因的方法，目前也有很多差异表达分析的方法，但比较简单也比较常用的是Fold change方法。

它的优点是计算简单直观，缺点是没有考虑到差异表达的统计显著性；通常以2倍差异为阈值，判断基因是否差异表达。Fold change的计算公式如下：

即用疾病样本的表达均值除以正常样本的表达均值。

差异表达分析的目的： 识别两个条件下表达差异显著的基因，即一个基因在两个条件中的表达水平，在排除各种偏差后，其差异具有统计学意义。我们利用一种比较常见的T检验（T-test）方法来寻找差异表达的miRNA。T检验的主要原理为：对每一个miRNA计算一个T统计量来衡量疾病与正常情况下miRNA表达的差异，然后根据t分布计算显著性p值来衡量这种差异的显著性，T统计量计算公式如下：

差异倍数(fold change)

fold change翻译过来就是倍数变化，假设A基因表达值为1，B表达值为3，那么B的表达就是A的3倍。一般我们都用count、TPM或FPKM来衡量基因表达水平，所以基因表达值肯定是非负数，那么fold change的取值就是(0, +∞).

为什么我们经常看到差异基因里负数代表下调、正数代表上调？因为我们用了log2 fold change。

当expr(A) < expr(B)时，B对A的fold change就大于1，log2 fold change就大于0（见下图），B相对A就是上调；

当expr(A) > expr(B)时，B对A的fold change就小于1，log2 fold change就小于0。

通常为了防止取log2时产生NA，我们会给表达值加1（或者一个极小的数），也就是log2(B+1) - log2(A+1). 【需要一点对数函数的基础知识】

为什么不直接用表达之差，差值接有正负啊？

假设A表达为1，B表达为8，C表达为64；直接用差值，B相对A就上调了7，C就相对B上调了56；用log2 fold change，B相对A就上调了3，C相对B也只上调了3. 

通过测序观察我们发现，不同基因在细胞里的表达差异非常巨大，所以直接用差显然不合适， 用log2 fold change更能表示相对的变化趋势。

虽然大家都在用log2 fold change，但显然也是有缺点的：

一、到底是5到10的变化大，还是100到120的变化大？

二、5到10可能是由于技术误差导致的。所以当基因总的表达值很低时，log2 fold change的可信度就低了，尤其是在接近0的时候。

A disadvantage and serious risk of using fold change in this setting is that it is biased[7] and may misclassify differentially expressed genes with large differences (B − A) but small ratios (B/A), leading to poor identification of changes at high expression levels. Furthermore, when the denominator is close to zero, the ratio is not stable, and the fold change value can be disproportionately affected by measurement noise.

差异的显著性(P-value) 

这就是统计学的范畴了，显著性就是根据假设检验算出来的。

假设检验首先必须要有假设，我们假设A和B的表达没有差异（H0，零假设），然后基于此假设，通过t test（以RT-PCR为例）算出我们观测到的A和B出现的概率，就得到了P-value， 如果P-value<0.05，那么说明小概率事件出现了，我们应该拒绝零假设，即A和B的表达不一样，即有显著差异。

显著性只能说明我们的数据之间具有统计学上的显著性，要看上调下调必须回去看差异倍数。

对于得到的显著性p值，我们需要进行多重检验校正（FDR），比较常用的是BH方法（Benjamini and Hochberg, 1995）。

这里只说了最基本的原理，真正的DESeq2等工具里面的算法肯定要复杂得多。

这张图对q-value（校正了的p-value）取了负log，相当于越显著，负log就越大，所以在火山图里，越外层的岩浆就越显著，差异也就越大。

只需要看懂DEG结果的可以就此止步，想深入了解的可以继续。

下面可以继续讨论的问题有：

1、RNA-seq基本分析流程/2、

2、DEG分析的常用算法/3、

3、常见DEG工具的方法介绍和相互比较

前言

做生物生理生化生信数据分析时，最常听到的肯定是“差异(表达)基因分析”了，从最开始的RT-PCR，到基因芯片microarray，再到RNA-seq，最后到现在的single cell RNA-seq，统统都在围绕着差异表达基因做文章。

（开个脑洞：再下一步应该会测细胞内特定空间内特定基因的动态表达水平了）

表达量 ：我们假设基因转录表达形成的mRNA的数量反映了基因的活性，也会影响下游蛋白和代谢物的变化。我们关注的是 基因的表达 ，不是结构，也是不是isoform。

为什么差异基因分析这么流行？

一是中心法则得到了确立，基因表达是核心的一个环节，决定了下游的蛋白组和代谢组；

二是建库测序的普及，获取基因的表达水平变得容易。

在生物体内，基因的表达时刻都在动态变化，不一定服从均匀分布，在不同时间、发育程度、组织和环境刺激下，基因的表达肯定会发生变化。

差异基因分析主要应用在：

发育过程中关键基因的表达变化 - 发育研究

突变材料里什么核心基因的表达发生了变化 - 调控研究

细胞在受到药物处理后哪些基因的表达发生了变化 - 药物研发

目前我们对基因和转录组的了解到什么程度了？

基本的建库方法？建库直接决定了我们能测到什么序列，也决定了我们能做什么分析！

基因表达的normalization方法有哪些？

第一类错误、第二类错误是什么？

多重检验的校正？FDR？

10x流程解释

The mean UMI counts per cell of this gene in cluster i

The log2 fold-change of this gene's expression in cluster i relative to other clusters 

The p-value denoting significance of this gene's expression in cluster i relative to other clusters, adjusted to account for the number of hypotheses (i.e. genes) being tested.

The differential expression analysis seeks to find, for each cluster, genes that are more highly expressed in that cluster relative to the rest of the sample. Here a differential expression test was performed between each cluster and the rest of the sample for each gene.

The Log2 fold-change (L2FC) is an estimate of the log2 ratio of expression in a cluster to that in all other cells. A value of 1.0 indicates 2-fold greater expression in the cluster of interest.

The p-value is a measure of the statistical significance of the expression difference and is based on a negative binomial test. The p-value reported here has been adjusted for multiple testing via the Benjamini-Hochberg procedure.

In this table you can click on a column to sort by that value. Also, in this table genes were filtered by (Mean UMI counts > 1.0) and the top N genes by L2FC for each cluster were retained. Genes with L2FC < 0 or adjusted p-value >= 0.10 were grayed out. The number of top genes shown per cluster, N, is set to limit the number of table entries shown to 10000; N=10000/K^2 where K is the number of clusters. N can range from 1 to 50. For the full table, please refer to the "differential_expression.csv" files produced by the pipeline.

不同单细胞DEG鉴定工具的比较

Comparative analysis of differential gene expression analysis tools for single-cell RNA sequencing data

For data with a high level of multimodality, methods that consider the behavior of each individual gene, such as DESeq2, EMDomics, Monocle2, DEsingle, and SigEMD, show better TPRs. 这些工具敏感性高，就是说不会漏掉很多真的DEG，但是会包含很多假的DEG。

If the level of multimodality is low, however, SCDE, MAST, and edgeR can provide higher precision. 这些工具精准性很高，意味着得到的DEG里假的很少，所以会漏掉很多真的DEG，不会引入假的DEG。

time-course DEG analysis

Comparative analysis of differential gene expression tools for RNA sequencing time course data 

参考：

Question: How to calculate "fold changes" in gene expression?

Exact Negative Binomial Test with edgeR

Differential gene expression analysis