基因差异火山图怎么看

Posted 2023-05-02

基因差异火山图看法如下：

火山图可反映总体基因的表达情况，横坐标代表log2（Fold Change）,纵坐标表示-log10（P值），每个点代表一个基因，颜色用以区分基因是否差异表达，图中橙色的点代表差异表达基因，蓝色的点代表没有差异表达的基因。聚类图聚类图可以衡量样本或基因之间表达的相似性。

在聚类图中，横坐标代表样本聚类，一列代表一个样本，聚类基于样本间基因表达的相似性，样本间基因表达越接近，靠的越近，以此类推。

纵坐标代表基因聚类，一行代表一个基因，聚类基于基因在样本中表达的相似性，基因在样本中表达越接近，靠的越近，以此类推。

色阶代表基因表达丰度，越红代表上调得越明显，越绿代表下调得越明显。

火山图先关：

火山图（Volcano Plot）是一类用来展示组间差异数据的图像，因为在生物体发生变化时从全局角度而言大部分的基因表达没有或着发生了很小程度的变化，只有少部分基因的表达发生了显著的变化。故而，火山图常见于RNA表达谱和芯片的数据分析中，最常用于分析基因的差异表达，近年来也陆续有其他组学的应用，此处不做详述。

火山图的本质是一个Plus版的散点图，其中包含两个重要的概念：

1）显著性，也就是p-value，差异性检验两组样本的p值，以负对数-log10（P-value）转换做为纵坐标；

2）以log2（Fold Change）为横坐标，即可得火山图，利用一定的筛选条件（如Fold Change大于2倍，显著性P值小于0.05），即可筛选出显著差异表达的基因，进行后续研究。

如果大家用的是DEseq2分析RNA表达谱的数据，分析结果应该如下，其中

log2FoldChange是表达量的log2（Fold Change）值，padj列示矫正后的pvalue，这两列也就是我们画火山图需要的两列。

首先，我们把DEseq的输出格式转换成dataframe格式，用函数as.data.frame()，并用head查看其前6行，如下：

df <- as.data.frame(res)
head(df)

接下来按照P<0.05, log2FoldChange > 2 或者log2FoldChange < -2进行下调和上调表达的颜色设置：

设定分组并赋值给变量color，我们把P<0.05, log2FoldChange > 2定义为上调，颜色设置为红色，把P<0.05, log2FoldChange < -2定义为下调，颜色设定为蓝色，其他既不上调也不下调的颜色设定为灰色，见代码如下：

df$color <- ifelse(df$padj < 0.05 & abs(df$log2FoldChange) >= 2,ifelse(df$log2FoldChange > 2 ,'red','blue'),'gray')

设定好分组，还需要给分组指定颜色：

r color<- c(red = "red", gray = "gray", blue ="blue")

绘图的完整代码在这里：

p <- ggplot(df, aes(log2FoldChange, -log10(padj), col = color)) +
geom_point() +
theme_bw() +
scale_color_manual(values = color) +
labs(x="log2 (fold change)",y="-log10 (q-value)") +
geom_hline(yintercept = -log10(0.05), lty=4,col="grey",lwd=0.6) +
geom_vline(xintercept = c(-2, 2), lty=4,col="grey",lwd=0.6) +
theme(legend.position = "none",
panel.grid=element_blank(),
axis.title = element_text(size = 16),
axis.text = element_text(size = 14))
p

代码部分需要注意的亮点：

1）对qvalue做了一个log10的转换

2）画纵轴阈值线的时候做了-log10(0.05)

3）其他绘图参数和理念都是和绘制散点图是一样的

参考技术A 今天就先来聊聊如何看差异表达基因数据，火山图，聚类图又怎么看。1差异基因筛选方法那差异基因是如何筛选出来的呢？差异基因的筛选方法有很多，包括倍数法、T检验、F检验及SAM等。
下面简单介绍一下GCBI平台上用的倍数法和SAM法。
倍数法适用于没有生物学重复的样本，其计算基因在两个条件下表达水平的比值，确定比值的阈值，将绝对值大于此阈值的基因判断为差异基因。
SAM算法适用于有生物学重复的样本，通过对分母增加一个常量 T 检验过程减小了假阳性发生的概率。文献中报道，相较于其他算法，SAM算法更为稳定，筛选出的结果也更为准确。2差异基因数据解读经过合适的差异基因方法筛选出的差异基因，结果一般分为两部分，数据+图形。
数据结果展示如下图所示（两分组）众多参数中，重点看三个。p-value或q-value没有做生物学重复请跳过这一步。

p-value或q-value是统计学检验变量，代表差异显著性，一般p-value或q-value小于0.05代表具有显著性差异，但可根据具体情况适当调整。
因为p-value或q-value衡量地是某个基因假阳性的概率，如果p-value或q-value越低，那么挑选该基因出现假阳性的概率就越低，可验证性就越高。
两者具体的计算方法具体如下：那p-value、q-value同时存在时看哪个呢？

SAM法只有q-value。当两者同时存在时，可根据具体情况具体分析。
差异筛选是一个典型的多重假设检验过程，对于多重假设检验，单次检验中差异显著基因的假阳性率(p-value较小)可能会较大，而q-value和FDR值较常见的BH校正方法得到的FDR值而言，改进了其对假阳性估计的保守性。
即q-value相比于p-value更加严格，当差异基因结果较少时，可以退而求其次看p-value。Fold ChangeFold Change表示实验组比上对照组的差异表达倍数，一般表达相差2倍以上是有意义的，放宽要求1.5倍或者1.2倍也可以接受。
看表达倍数的同时还需结合基因表达丰度，信号值太低的基因会在后续的验证实验中检测不到。3差异基因图表解读在差异结果的图形展示结果中，主要是火山图和聚类图。火山图火山图只针对两分组且有生物学重复的情况。
如何看火山图呢？火山图可反映总体基因的表达情况，横坐标代表log2（Fold Change）,纵坐标表示-log10（P值），每个点代表一个基因，颜色用以区分基因是否差异表达，图中橙色的点代表差异表达基因，蓝色的点代表没有差异表达的基因。聚类图聚类图可以衡量样本或基因之间表达的相似性。
如上图所示的聚类图中，横坐标代表样本聚类，一列代表一个样本，聚类基于样本间基因表达的相似性，样本间基因表达越接近，靠的越近，以此类推。
纵坐标代表基因聚类，一行代表一个基因，聚类基于基因在样本中表达的相似性，基因在样本中表达越接近，靠的越近，以此类推。
色阶代表基因表达丰度，越红代表上调得越明显，越绿代表下调得越明显。

如何做聚类图请戳往期推送做个聚类图只需1分钟
差异基因有了，如何挑选潜在基因进行实验验证呢？
关键还在于感兴趣点在哪了。粗略的看，可以先看KEGG或者GO功能分类，看差异基因具体富集在哪些通路或功能。
比如关注的是细胞内脂肪酸合成关键酶，可以重点看脂肪酸合成和碳流相关通路。具体如何看KEGG或者GO功能分类，请听下回分解。

R语言DESeq2基因差异表达分析

参考技术A

经过表达定量后，我们已经得到了基因的表达量矩阵，差异表达分析通常是RNA-seq分析的第一步。

差异基因表达分析通常都是在R中，常用的有DESeq2，edgeR，limma等几种，这次主要介绍用DESeq2来进行差异表达分析。

需要准备的数据：基因表达定量矩阵（counts）及分组文件

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