WES 平均测序深度

Posted 2020-10-01

http://blog.csdn.net/guomutian911/article/details/70312973

 

 

1 基础概念

平均测序深度：

指定区域内得到的所有碱基数目与该区域的长度的比值，如果是全基因组，就是整个测序的碱基数目除以基因组的大小。比如人类的基因组大小是3G(30亿个碱基)，我的全基因组测序共8.9亿条150bp的reads，那么全基因组范围的平均测序深度就是8.9亿*150/30亿~45X，这个概念很重要！

覆盖度：

指测序获得的序列占整个基因组(或者指定区域)的比例。由于基因组中的高GC、重复序列等复杂结构的存在，测序最终拼接组装获得的序列往往无法覆盖有所的区域，这部分没有获得的区域就称为Gap。例如一个细菌基因组测序，覆盖度是98 %，那么还有2%的序列区域是没有通过测序获得的。
（你想实际测到的占你想测的区域比例。）
由于我们研究目的不一样，通常我们不需要覆盖到全基因组，所以就有了各种针对性的组学技术，也就是我们需要明白的！

2 理概念

理解了上面的测序深度和覆盖度的概念，我们就可以根据它们来区分WGS,WES,RNA-seq组与ChIP-seq，简单地说就是搞清楚这些组学要测什么，而且测多深即可。

全外显子(Whole-exome sequencing)：

首先外显子组（Exome）是指真核生物基因组中全部外显子区域的总和，包含了蛋白质合成最直接的信息。外显子 组测序（Exome-seq）是利用设计好的探针试剂盒将坐标已知的全基因组外显子区域的DNA捕捉并富集后，进行高通量测序的基因组分析方法。 对于人类基因组来说，外显子区域大概占到基因组的1%，大概在30M左右。

一般全外显子测序的测序深度为50X~200X，具体深度依研究目的而定，其个体之间的变异小（在VCF文件上记录着少许差异，一点点）。

转录组测序（RNA-seq）：

首先转录组是指在相同环境（或生理条件）下的在一个细胞、或一群细胞中所能转录出的所有RNA的总和，包括信使RNA（mRNA）、核糖体RNA（rRNA）、转运RNA（tRNA）及非编码RNA。转录组测序（RNA-seq）是将提取所要研究的特定类型的RNA，将其反转录成cDNA，利用高通量测序技术获得某一物种特定组织或器官在某一状态下的几乎所有转录本序列信息。对于已知参考基因组的物种，所获得大部分序列是已知的，同时会有一些新的转录本会被检测到，几乎可以忽略；甚至处于不同状态的人，其转录组数据有所不同。因此其主要的研究点——研究随着时空的变化、组织的变化、样本的变化，转录本发生改变。

染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）：

主要用于蛋白质与DNA相互作用研究，采用特异抗体对目的蛋白进行免疫沉淀，分离与目的蛋白结合的基因组DNA片段，对其进行纯化和文库构建，再通过高通量测序的方法，在全基因组范围内寻找目的蛋白的DNA结合位点，从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA片段信息。（与外显子测序不一样，不是通过设计好的探针来捕获序列的，而是通过特异的RNApoly酶、组蛋白、转录因子来捕获序列的，蛋白结合在哪里就捕获哪里。每做一次实验，换一个蛋白，所捕获的序列是不一样的。）因此其主要研究点——研究用不同组蛋白、转录因子等不同蛋白来做不同的实验，找出互作的DNA序列的不同。

3 明差异

测序范围的区别：

全外显子测序测的是所有的能被探针捕获到的外显子区域，在IGV上面能看到reads都是覆盖到外显子及其侧翼区域。所以分析要点就是哪些已知的外显子覆盖度不够好，是探针捕获失败还是样本本身变异呢？外显子的哪些区域跟参考基因组序列不一样呢？
转录组测序测的是能被转录的区域，不需要是已知的外显子，而且reads是可以跨越外显子比对的！所以分析要点是哪些外显子被连接起来了？每个外显子都被覆盖了吗？
ChIP-seq测的是目标蛋白结合的DNA序列，取决于目标蛋白的结合能力，所以它的分析要点就是这些DNA序列在基因组的位置。

测序深度的区别：

全外显子测序的测序深度在大部分区域都是均匀的(反应捕获效果，或者拷贝数变异)；
转录组测序一定是不均匀的，以外显子为单位的不均匀(反应表达量差异)；
染色质免疫共沉淀测序的测序深度也是不均匀的，以每个碱基为单位的不均匀(反应蛋白结合位点)；