液滴型单细胞测序技术的比较
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篇首语：本文由小常识网(cha138.com)小编为大家整理，主要介绍了液滴型单细胞测序技术的比较相关的知识，希望对你有一定的参考价值。
参考技术A单细胞测序方法和原理系列：
单细胞转录组技术简史
基于液滴的方法包括15年背靠背发在cell上的 Drop-seq 和 inDrop ，还有17年发在NC上的 10X Genomics Chromium 。
三种液滴型方法采用相似的技术生成液滴，采用barcode标记细胞，应用UMI进行偏好校正。但它们在beads的制造、barcode的设计、cDNA扩增等不同。
三种方法的比较2019年发在molecular cell上
三种平台中，Drop-seq和inDrop的细节在15年的cell中描叙的非常详尽。而10X作为商用平台，技术细节未完全披露（整合了inDrop和Drop-seq）
三种技术的珠子上的序列大体类似，包含PCR handle, cell barcode, UMI和poly-T。inDrop的beads还带有photo-cleavable moiety和一个T7启动子。
但是10X和inDrop采用的是有弹性的水凝胶beads (hydrogel)，引物可以固定在beads里面，而Drop-seq使用的是聚苯乙烯固体磁珠，引物只能固定在beads表面。相较于Drop-seq体积较小的固体磁珠，inDrops与10x的胶体珠可以在微流控管道交汇处形变，能够耐受挤压，流速可控，最终可以达到几乎全部(98%)液滴含有规定数量的胶体珠（实现方差的超级小），在磁珠相打破了泊松分布(Sub-Poisson loading)，实现了超泊松分布（super-Poissonian distribution）（仅细胞相服从泊松分布），从而大大提高了细胞的捕获率。（参考： 基于液滴的单细胞测序通量：泊松分布与次泊松分布 ）
包裹到液滴后，10X的beads发生溶解，引物释放到溶液中可以提高mRNA的捕获效率。inDrop使用紫外诱导的切割技术释放引物。而DropSeq的引物不能从beads释放，会降低其mRNA捕获效率。
此外，DropSeq和10X的反转录等过程都在液滴内进行，有利于提高效率和降低试剂消耗。inDrop采用体外转录方式进行扩增，需要时间比较久。关于cDNA扩增的方法，inDrop使用的是 CEL-seq ，10X和Drop-seq使用的则是类似于Smart-seq的template-switching protocol。参考 单细胞转录组建库原理：SMART、TargetAmp和10X genomics
为了比较不同平台产生的数据，研究团队开发了可适用于三个分析平台的数据分析框架，方便数据比较。
结果显示：
但是10X Genomics微珠的条形码错配较少，另外两个平台有超过一半的细胞条形码出现明显的错配。其中，Drop-seq约10%微珠的条形码出现一个碱基缺失。
液滴型scRNA-seq方法中只有一小部分的液滴包含珠状物和一个完整细胞。然而生物实验不会那么理想，有些RNA会从死细胞或破损细胞中漏出来。所以没有完整细胞的液滴有可能捕获周围环境游离出的少量RNA并且走完测序环节出现在最终测序结果中。液滴大小、扩增效率和测序环节中的波动会导致“背景”和真实细胞最终获得的文库大小变化很大，使得区分哪些文库来源于背景哪些来源于真实细胞变得复杂。
大多数方法使用每个barcode对应的总分子数(如果是UMI)或总reads数的分布来寻找一个“break point”区分来自于真实细胞的较大的文库和来自于背景的较小的文库。
CellRanger假设真实细胞文库大小变化在10倍以内，用期望的细胞数目估计区间的分布。
液滴型单细胞测序平台各有优缺点，适用于不同应用。总体来说，10X Genomics的Chromium系统比Drop-seq或inDrop表现更强大，其技术噪音最小，稳定性最高。
单细胞测序方法大比拼
〖生物技术〗单细胞测序方法大比拼
在单细胞研究的大潮中，新的测序方法层出不穷。不过，很少有人对这些方法进行系统的比对。慕尼黑大学生物学家Wolfgang Enard最近领导团队，在小鼠胚胎干细胞的基因表达研究中比较了一些常用的单细胞测序方法，包括Smart-seq、CEL-seq、SCRB-seq和Drop-seq。
SMART（Switching mechanism at 5’ end of the RNA transcript）是一个具有里程碑意义的重要技术。实际上，能够从单细胞生成全长cDNA的测序方案并不多，Smart-seq就是其中之一。对于等位基因特异性表达或者剪接变体研究来说，覆盖整个转录组是一件非常重要的事情。
Fluidigm C1单细胞制备系统能够自动完成Smart-seq步骤。你只需要将制备好的细胞悬液加进去，仪器就会分离并裂解细胞，把mRNA逆转录为cDNA，再对cDNA进行扩增。扩增后的cDNA可以拿来测序，也可以进行qPCR检测。
在Enard的比较研究中，Fluidigm C1系统的Smart-seq最为灵敏，成本也最高。这一系统使用的微流体芯片不能重复使用，不过这种芯片可以放到显微镜下观察，证实健康单细胞的存在。
CEL-seq（Cell expression by linear amplification and sequencing）是一种采用线性扩增的常用测序方法。线性扩增的主要优势是错误率比较低，不过线性扩增和PCR都存在序列依赖性偏好。
CEL-seq技术发表于2012年，主要是分离单细胞，逆转录带有poly-A 尾巴的mRNA片段，给它们贴上代表其细胞来源的条码。2014年Science杂志发布的MARS-seq与CEL-seq很类似。
CEL-seq和其他线性扩增方法生成文库花费的时间要稍微长一点。不过，CEL-seq在早期阶段就给样本贴上条码并进行混合，大大减少了手动操作的时间。PCR是在最后阶段使用的，主要是为了连接正确的测序接头，CEL-seq开发者纽约大学的Itai Yanai介绍到。
CEL-seq所需试剂都是现成的，大约两天时间生成测序文库和测序数据，Yanai指出。需要注意的是，CEL-seq与大多数方案一样，测序转录本的3’端。Enard等人并没有亲自尝试着一技术，只是在比较研究中用到了CEL-seq数据。从这项研究来看，CEL-seq的重现性最好。
GitHub网站提供有CEL-seq可用的生物信息学工具。Yanai研究团队正在开发新版本CEL-seq2，新版本的灵敏度将比旧版本高三倍。
Broad研究所开发的SCRB-seq（single-cell RNA barcoding and sequencing）技术采用的是PCR扩增。该技术需要结合流式细胞仪（FACS）或者其他细胞分选方法，把单细胞分配到微孔里去。
SCRB-seq与Smart-seq比较相似，只不过SCRB-seq会整合特异性的细胞条码，以分辨扩增分子的来源，更准确的定量转录本。此外，SCRB-seq并不生成全长cDNA，而是像CEL-seq一样富集RNA 3’端。
2014年，开发者们将SCRB-seq技术提前发布在BioRXiv上。随后他们对这一技术进行了更新，并将其更名为“high-throughput eukaryote 3’ digital gene expression”。Broad研究所仍提供有SCRB-seq技术服务，SCRB-seq也被整合到了Wafer GenBio systems公司的scRNA-seq平台上。据说Fluidigm公司的C1系统很快也将支持SCRB-seq方案。SCRB-seq目前是Enard最中意的测序方法，它不仅适用于单细胞RNA测序，还能支持大量细胞（bulk）的RNA测序。可惜的是SCRB-seq并不好DIY，研究者自己很难将测序流程与FACS对接起来。
哈佛医学院的研究人员开发了以微滴为基础的两种独立技术Drop-seq和inDrop。他们利用微流体装置将带有条码的微珠和细胞一起装入微小的液滴，建立了快速、廉价、高通量的单细胞RNA-seq方法。这两种技术将细胞隔离在微小的液滴中，装上用于扩增的条码引物，由此检测数以千计的细胞。研究者们认为，Drop-seq和inDrop能够帮助生物学家进一步发现和分类人体细胞，绘制大脑等复杂组织的细胞多样性图谱，更好地了解干细胞分化，获得更多疾病的遗传学信息。
Enard及其同事发现，Drop-seq在单个细胞中检测的基因数还不到Smart-seq/C1、CEL-seq和SCRB-seq的一半。不过，在统计学水平上研究差异性表达的时候，高通量Drop-seq和SCRB-seq是最划算的。哈佛医学院Steve McCarroll实验室去年下半年根据用户反馈，在自己网站上公布了3.1版的Drop-seq（mccarrolllab.com/dropseq）。
参与开发SCRB-seq的Stefan Semrau正在搭建自己的Drop-seq平台。Semrau从Whitehead生物医学研究所搬到Leiden物理研究所的时候，发现自己用FACS已经不那么方便了，于是他为新实验室选择了Drop-seq。建立微流体芯片和液滴系统是整个过程中最艰难的部分，不过Semrau实验室的一名微流体博士后仅用三周就搞定了这些问题。Drop-seq文库制备是任何分子生物学研究者都熟悉的标准操作。据Semrau估计，搭建和优化Drop-seq大概只需要六个月时间。
四种单细胞RNA-seq方法比较
以上是关于液滴型单细胞测序技术的比较的主要内容，如果未能解决你的问题，请参考以下文章