单细胞mRNA测序技术

Posted 2023-03-13

参考技术A

主要建库方法 包括：Clontech公司的SMART法以及Epicentre公司推出的TargetAmp法。

单细胞测序的难题 ：细胞中的RNA含量少，mRNA含量仅有约0.2pg(1pg=1 10^-12g)， 第一个难题 是核酸的扩增量要达到几百万倍。核酸扩增过程可能会引起偏差，这是一直以来需要解决的问题， PCR偏差 指的是扩增过程中某些片段被大量扩增，而大量片段扩增量很少，这样就会导致后续的测序没有意义。 第二个难题 *是如何尽可能高效的得到 mRNA文库 ，而不是含有大量 rRNA 的文库 (rRNA占比总RNA95%的比例)。

SMART(Swiching Mechanism at 5\' End of RNA Template） 方法： 设计特殊的序列识别 mRNA polyA尾巴 ，引物的末端特殊结构发挥定位到 polyA尾的作用 ， 配合 MMLV逆转录酶 合成第一链，这个酶的特殊之处在于会在合成的 cDNA 末端多加出几个 C碱基 ，刚好可以结合上游引物，在 MMLV酶 再次发挥聚合作用，引导合成第二链，这样就得到了双链的cDNA序列，并且附带了人工设计的引物，接下来只需要加入常规的PCR引物进行扩增，继而进行常规的 超声打断，建库，上机测序 。SMART建库技术对单个细胞测序， RPKM 为10的基因60%是被测到的， RPKM 为100的基因有90%可以测到。

TargetAmp方法： 使用 T7-Ologo(dT) 的引物进行cDNA合成，与mRNA的polyA尾巴结合，作为逆转录的起始引物，得到第一链cDNA，且该cDNA链上引入了一个T7启动子，应用 RNase:H酶 将cDRNA:RNA链中的RNA链消化掉，再继续合成cDNA第二链。以得到的双链cDNA链为转录模板转录出 反义RNA链 ，纯化后再用随机引物进行纯化得到第二轮的cDNA, 再次使用 T7-Ologo(dT) 引物连接到cDNA的polyA尾巴，再次进行逆转录，合成双链DNA,转录为反义RNA( 达到微克级 ）,再经过一轮逆转录就足够用于建库测序了。 特点：通过转录扩增核酸的量,而不是PCR 。

10Xgenomics系统分析单细胞表达： 该系统可以完成一群细胞当中，每个单细胞的RNA表达情况的定量分析。还可以完成染色体的单倍体长片段的组装。 10X工作原理 是先预制凝胶微珠(gel beads)，微珠上种上特定的DNA片段，DNA序列的第一段是 Barcode(总共包含400万种，与微珠一一对应） 。第二段是 UMI(unique multiplex index)序列 ,UMI是一段随机序列，每一个DNA都有自己的UMI序列，其作用是在经过PCR再深度测序得到的reads,可以看出哪些reads是来自于一个原始cDNA分子的, 可以将起始于1个cDNA分子的reads简并为一个cDNA。 简单的理解即， Barcode是微珠的ID, UMI是DNA分子的ID ，UMI后的序列是 poly(dT序列） ，其作用是与mRNA的polyA尾结合，作为逆转录的引物，逆转录为cDNA。芯片液流管系统使得细胞包裹到有微珠的小液滴当中，细胞悬液中约有65%的细胞会完成包裹，这些细胞会在后续分析中给出信号。得到乳浊液之后使细胞破膜，游离出mRNA, 使其与逆转录酶，凝胶微珠上的核算引物，底物等相接触， mRNA与微珠上带标签的DNA分子结合，在逆转录酶的作用下逆转录为cDNA（cDNA也带有了特有的Barcode标签） ，抽提出带有标签的cDNA分子，再把这些cDNA分子加上接头，经过PCR扩增，做成illumina测序文库，上机测序，测序完成之后进行数据分析。每一次测几百到几千个细胞，通过Barcode拆分数据，可以把测序得到的reads归属到一个一个细胞，再通过UMI对reads进行简并之后，就可以看到一个细胞被读到了多少基因。

参考内容：陈巍学基因