技术 单细胞转录组测序之10x Genomics

Posted 2023-04-16

参考技术A

10X Genomics 是一个综合的单细胞测序技术平台，可以应用于多种单细胞测序上，包括Single cell gene expression, Single cell Immune Profiling, Single cell CNV, Single cell ATAC。这篇文章将主要简述10X Genomics在 单细胞基因表达 检测方面，也就是scRNA-seq上的应用。

10X Genomics 一次测序可以捕捉 100-80,000个细胞 ，具有极高的细胞通量。单细胞的测序通量平均也在 50,000 reads/per cell 左右，而如果使用细胞核进行测序则平均通量为 25,000 reads/per nuclei。比起使用FACS进行细胞分选的单细胞测序技术而言，10X Genomics的细胞通量有显著的提高。

10X Genomics与其他测序技术的主要区别在于其 barcode和建库 的操作。虽然上样之后都是自动化操作，但了解其建库原理对后续的生物信息学分析也是有必要的。

10X Genomics运用微流控系统进行细胞分选，带有Barcode的Gel Beads 匀速地从左方进入，待分选的细胞和酶从下方以一定时间间隔进入，并与Gel Beads结合，进入油相中形成 GEMs(Gel Bead in emulsion)

Gel Beads上的Barcode带有一段每个细胞特异的 UMI ，在随后的文库构建中，只要是由该细胞扩增出的cDNA都会带上这段UMI以及前面的10x Barcode。因此，便可区分出不同细胞扩增出的cDNA。要注意的是，10X Genomics也是通过poly(dT)富集细胞的mRNA，会有无法避免的3‘ bias.

一般而言，每个GEMs会形成如上图一般的结构，即一个细胞一个gel beads。但有时候也会出现一个GEM里有0或多个细胞(empty droplet or doublet)，对于这种GEMs则需要通过我们在后续分析中识别出来并进行排除。

形成GEMs后， 细胞裂解后经过反转录(RT) —— cDNA generation 便形成cDNA文库。这一系列建库过程都在GEMs中发生，因此GEMs的存在相当于一个物理隔离，保证每个单细胞都在独特的“小室”中发生。另外，由于GEMs是在油相中形成了一种乳浊液(emulsion) 的形态 ，而乳浊液中会形成上万个微液滴，每一个微液滴就是一个GEMs，这也解释了为何10X Geonmics细胞通量如此之高的原因。

建库完成后，采用Illumina的测序仪进行测序，通常进行双端不等长测序。其中5\'测28nt检测barcode与UMI，3\'测90nt用于定量基因表达。

最后，测序完成后，现在的10X Genomics测序仪会同时进行一些简单的数据分析，包括每个样品的数据量，mapping rate，data filtering ，每细胞reads等等。当然，我们也可以自己拿数据跑Cell Ranger，随后可以用seurat包等进行后续的个性化分析也是没有问题的。

以上就是对10X Genomics平台的简单介绍。

完。

跟着Cell学单细胞转录组分析(五):单细胞转录组marker基因鉴定及细胞群注释

参考技术A 书接上回（ 跟着Cell学单细胞转录组分析(四):单细胞转录组测序UMAP降维聚类 ）。完成数据降维和细胞聚类后，最主要的环节和工作就是确定各个细胞群，明确是什么类型的细胞，正群的细胞定群很关键，涉及到整个研究，所以这一步宁愿多费时间，也不要出错。当然，这也不是一蹴而就的，需要反复的确认。

要确定各个群是什么细胞，首先需要了解细胞群的marker基因，因为不同类型的细胞突出 表达的基因也是不同的。这里使用FindAllMarkers鉴定各个细胞群的高表达基因。

Seurat提供了几种函数例如FeaturePlot()、DotPlot()和DoHeatmap()，按照文章中的mrker基因，做一下可视化。

点图：

UMAP图：

热图：

很显然，这些都是默认出图，距离发文章还是有一定距离的，后期我们会专门讲解个性化的修饰，争取可视化更好。

接下来就是细胞定群了，对各个细胞群命名。细胞定群有很多方法，目前也有很多工具，但是依照我的经验，自动定群等一般结果不是完全正确，况且操作复杂，为了保证正确性，最使用的办法还是查询文献定群。定群后，对细胞群重命名。

最后将命名的文件保存，可视化细胞群！在进行下一步工作之前，之后的内容将会是对目前这些图形结果的修饰和个性化可视化！