13基因组的拼接原理(转载沈梦圆的博客)

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篇首语:本文由小常识网(cha138.com)小编为大家整理,主要介绍了13基因组的拼接原理(转载沈梦圆的博客)相关的知识,希望对你有一定的参考价值。

最近学习了一下基因组的拼接原理,以下是我的学习笔记和一些思考。基因组的拼接原理是高通量测序技术的基础知识吧,我个人认为即使不做基 因组拼接工作,也可以学习一下几个主流拼接软件的算法和原理。我主要是学习了两个网上教程,其教程出处为https://github.com/ TGAC/361Division/tree/master/de_novo_2016https://github.com/ lexnederbragt/INF-BIO9120_fall2013_de_novo_assembly/tree/master/presentations

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拼接是个啥?

A hierarchical data structure that maps the sequence data to a putative reconstruction of the target.(Miller et al 2010,Genomics 95(6):315-327) 基因组拼接可以类比成一本书被碎纸机碎个稀巴烂,然后用胶水把他们一片片给拼回去的过程。 技术分享 技术分享

  • 拼接的过程就像一个黑箱处理过程,reads序列输入,经过拼接黑盒,输出就是基因组拼接好的结果。正确的拼接应该是The right motifs,the correct number of times,in correct order and position。我个人认为是尽可能得还原真实的基因组是拼接的终极目的。

  • 另外,拼接的算法分为试探型和穷举型两种,一般都用试探型算法,因为它更好更快更简单(在绝大多数时候)。穷举型算法局限性强、运行速度 慢、召回率低,并且数据类型不尽相同,因此没有很好的模型适合全部的数据类型。

  • 在拼接之前,我们确保输入的数据是去除接头、污染等的good data,并且要大概知道拼接的原理。最后完成拼接后,要检查拼接结果的可靠性和完整性。 技术分享

测序技术

测序长度越长,覆盖度越高,带来的拼接结果也会越好。并且根据研究目的的不同,我们使用不同测序技术,产生不同类型的数据,得到不同的测序 信息。 技术分享

拼接算法

None of which is assessed by length stats.

  • Overlap Layout Consensus 找到重叠区域并且定义他们是key。layout有点难度。这种方法tracks每一条read。Consensus是由reads构建而成的。 技术分享

  • De Bruijn Graphs 技术分享

  • OLC VS DE bruijn 技术分享 技术分享

拼接实验前

  • 有时候一次测序拼接结果可能很难达到预设的拼接目标,可能需要多次补测样品来完善拼接结果。我们在测序拼接前,需要知道所研究对象的基因 组的大小、倍型、杂合性、GC含量、是否有污染物/ 共生者、数据集的类型、是否线粒体还是叶绿体的细胞器基因组。其实这些内容在测序之前就需要考虑了,下面一些点进行进行较为详细的介绍 :

(1)基因组大小的获取关系到对以后组装结果的大小的正确与否判断;基因组太大(>10Gb),可能会超出了目前denovo组装基因组软件的对机器存 的要求,从客观条件上讲是无法实现组装的。一般物种的基因组大小可以从公共数据库查到。如果没有搜录,需要考虑通过实验(流式细胞仪福尔根 染色/定量pcr/)或Kmer估计法来获得基因组大小。

(2)杂合度对基因组组装的影响主要体现在不能合并姊妹染色体,杂合度高的区域,会把两条姊妹染色单体都组装出来,从而造成组装的基因组偏 大于实际的基因组大小。一般是通过SSR在测序亲本的子代中检查SSR的多态性。杂合度如果高于0.5%,则认为组装有一定难度。杂合度高于1%则很难 组装出来。杂和度估计一般通过kmer分析来做,降低杂合度可以通过很多代近交来实现。杂合度高,并不是说组装不出来,而是说,装出来的序列不 适用于后续的生物学分析。比如拷贝数、基因完整结构。

(3)随着测序对质量要求越来越高和相关技术的逐渐成熟,遗传图谱也快成了denovo基因组的必须组成。

(4)实验设计需要考虑的问题:1.明确我们的生物学问题;2.设计数据处理方案;3.设置实验条件和生物/技术重复数;4.选择测序平台和覆盖度。

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为啥拼接挺难的

  • 重复序列
  • 二倍体
  • 多倍性
  • 可供选择的软件多 技术分享

两个拼接软件

  • A modern assembler-SOAPdenovo2 技术分享
  • Trinity运行的原理和过程 1 Trinity 如何运作 a. 序列延伸 (inchworm) ——虫子 将 reads切为 k-mers (k bp长度的短片段) 拆分K-mer的目的:节省内存,降低测序错误对拼接的影响;利用Overlap关系对k-mers进行延伸 ( 贪婪算法);输出所有的序列 (“ contigs”)。 b. 构建 de Bruijn graph (chrysalis)—— 成蛹 聚类所有相似区域大于1kbp的 contigs;构图 (区分不同的 “components”); 将reads比对回 components,进行验证 c. 解图,列举转录本 (butterfly)——化蝶 拆分graph 为线性序列;使用reads以及 pairs关系消除错误序列。 2 组装质量评估与去冗余 d. 组装质量: 组装完整性、组装准确性、后续定量准确性、组装冗余度 N50长度,可以初步评估组装质量;但并非越长越好,应该参照相关的研究(同物种或近缘种);通过统计Unigene对近缘种编码基因的覆盖度分, 也可以从整体评估组装质量。 3 注释与其他

组装评估

(1) kmer spectra,可用软件KAT、CEGMA; 技术分享 (2)使用生物学知识去进行评估验证

  • Direct experimental evidence: the reads、Genome size、ploidy、GC content、Symbionts、Plastids、ESTs、cDNAs、peptides、genome walking
  • Indirect experimental evidence: genomes in general(Genes! (They have structure,Repeats),Chromosome macrostructure ,(circular?, number, telomeres, …))、other species(Close relatives: proteins, transcripts, genomes; Distant relatives: single-copy genes,?phylogeny, HGT)

误差和质控

样本的准备和建库:样品未纯化,PCR偏差(没有化学反应是perfect、complete的) 技术分享 技术分享 技术分享

N50并不是那么可靠、敏感,我们要注意。 技术分享 技术分享

其他参考资料

https://www.cbcb.umd.edu/research/assembly_primer

以上是关于13基因组的拼接原理(转载沈梦圆的博客)的主要内容,如果未能解决你的问题,请参考以下文章

Corset轻松搞定无参转录组差异基因(转载)

WGCNA(转载)

利用minimap2和samtools简化目标基因组拼接

细菌基因组拼接工具比较(二)

全基因组选择的模型汇总(转载)

【豆科基因组】大豆适应性位点GWAS分析[转载]