易基因：MeRIP-seq等揭示m6A甲基化修饰对抗病毒基因表达的转录调控机制｜Cell Rep

Posted 2023-04-20 E-GENE

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2021年03月02日，杜克大学医学中心的分子遗传学和微生物学系Stacy M. Horner教授团队在《Cell Reports》（IF: 9.995）杂志发表了题为“Post-transcriptional regulation of antiviral gene expression by N6-methyladenosine”的研究论文，研究通过MeRIP-seq（m6A-seq）等实验揭示了m6A在抗病毒限制的I型干扰素（interferon，IFN）响应期间对IFN刺激基因（IFN-stimulated genes ，ISG）翻译的转录调控机制。

标题：Post-transcriptional regulation of antiviral gene expression by N6-methyladenosine

时间：2021.03.02

期刊：Cell Reports

影响因子：IF 9.995

技术平台：MeRIP-seq、RNA-seq、Ribo-seq、MeRIP-qRT-PCR、荧光素酶活性分析实验等

 

研究摘要

I型干扰素（interferon，IFN）通过诱导数百种IFN刺激基因（ISG）来响应病毒感染，必须调节这些ISG的诱导以实现有效和可调控的抗病毒感染响应，但这些基因的转录调控机制尚不明确。本研究首先鉴定了RNA碱基修饰N6-甲基腺苷（m6A）在ISG调控中的作用，通过Ribo-seq和定量质谱法结合m6A免疫沉淀测序（MeRIP-seq）分析，鉴定出包含IFITM1的ISG亚群，其翻译通过m6A和m6A甲基转移酶蛋白METTL3和METTL14增强。研究进一步表明m6A识别蛋白（readers）YTHDF1以m6A结合依赖性方式上调IFITM1表达，且m6A甲基转移酶复合体可以促进I型IFN的抗病毒活性。总之，本研究表明m6A在抗病毒限制的I型IFN响应期间对ISG翻译的转录调控中发挥作用。

 

实验结果

（1）METTL3/14调节某些ISG的翻译

IFN-β通过诱导ISG转录形成对病毒感染的响应。为研究m6A是否调节I型IFN响应，本研究对Huh7细胞中m6A甲基转移酶复合体METTL3/14缺失后，IFN-β诱导的几种具有抗病毒功能的ISG表达进行检测。在METTL3/14敲除后，IFN-β诱导的ISG IFITM1和MX1蛋白表达降低（图1A），同时在A549细胞、原代新生儿人真皮成纤维细胞（NHDF）和Huh7细胞中IFN-β处理后的多个时间点（8h、16h和24h）观察到相似结果；但MX1蛋白水平在A549和NHDF细胞中的影响不如在Huh7细胞中强烈。而为响应IFN-β，METTL3/14过表达增加了Huh7细胞中的IFITM1和MX1丰度，但没有增加ISG15和EIF2AK2的丰度（图1B）。METTL3/14调节的ISG IFITM1和MX1在没有IFN-β的情况下不表达，表明METTL3/14动态变化对内源性IFN-β的任何混杂效应可以忽略不计（图1A和1B）。

图1：METTL3/14调节某些ISG的翻译

（A-B）在模拟或IFN-β（24h）处理之前，用siRNA转染METTL3/14（M3/14）或对照（CTRL）（A）或稳定过表达FLAG-METTL14（M3/14OE；上箭头表示FLAG-METTL14；下箭头表示内源性METTL14）（B）的Huh7细胞提取物的免疫印迹分析。相对于非靶向对照（siCTRL）+IFN-β（A）或WT+IFN-（B），对A和B中4个重复的相对ISG表达进行定量。

（C-E）用CTRL或METTL3/14 siRNA转染后经IFN-β处理的Huh7细胞提取物中分离24个蔗糖梯度级分中的IFITM1（C）、MX1（D）和GAPDH（E）mRNA相对百分比qRT-PCR分析。未初始化（游离、40S和60S亚基）、初始化（80S）、低分子量或高分子量多核糖体。右边的图表显示了IFITM1、MX1或GAPDH组合级分中的mRNA百分比。将各部分的百分比相加得出各类别的总百分比。

数值为4个生物学重复（A和B）的平均值±SEM，3个技术重复平均值±SD，表示3个实验（C–E，左图）和3个生物学重复的平均值±SEM（C–E，右图）。*非配对Student\'s t检验（A和B）和Sidak多重比较检验的双向方差分析（C–E），*p<0.05，***p<0.01，***p<0.005，ns，不显著。

为研究METTL3/14如何调节某些ISG的蛋白水平，研究首先分析METTL3/14缺失是否导致ISG mRNA对IFN-β响应减少。同时，在IFN-β处理后使用RNA测序（RNA-seq），结果显示METTL3/14缺失对核心ISG的mRNA表达丰度影响很小，表明ISG RNA稳定性不受METTL3缺失的影响。

由于METTL3/14缺失导致IFITM1和MX1蛋白减少而不影响其转录水平，本研究分析METTL3/14是否调节其蛋白稳定性。研究结果表明METTL3/14不能检测到Huh7细胞中这些ISG的出核或蛋白质稳定性。

为了检测METTL3/14是否调节IFITM1翻译，作者检测了其在对照细胞或IFN-β处理后METTL3/14缺失的细胞中的多核糖体（polysome）百分比。结果显示METTL3/14缺失不改变总多核糖体水平，但METTL3/14缺失会导致80S级分中IFITM1 mRNA水平较低，且从重多核糖体级分转换为轻多核糖体级分（图1C），表明METTL3/14缺失后IFITM1翻译受损。另外，在MX1（图1D）中也观察到类似但不太明显的变化，但在GAPDH（图1E）中没有观察到。总之结果表明，METTL3/14调节某些ISG的翻译，如IFITM1和MX1。

 

（2）METTL3/14调节的ISG被m6A修饰

为确定METTL3/14调节的ISG IFITM1和MX1以及其他ISG是否被m6A修饰，研究通过使用甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq）在Huh7细胞中绘制了IFN诱导的转录组m6A图谱，在鉴定出ISG后，将m6A免疫沉淀后reads覆盖率的peaks，与使用MeTDiff m6A peaks calling的input进行比较。结果显示mRNA peaks在编码序列末端和3′UTR起始位点富集（图2A）。peaks内最富集的RNA序列motif为[U/A]GGAC，这与DRAmC已知m6A motif匹配（图2A）。约85%的ISG（分类为IFN后上调超过4倍的ISG）被m6A修饰，而Huh7细胞表达转录组中比例为74%（平均覆盖率≥10）（图2B）。该结果与先前的研究一致，该研究发现ISG以与转录组相似的百分比进行m6A修饰。m6A修饰的ISG百分比在其他类别的ISG中相似，包括脊椎动物中进化保守的“核心”ISG和具有已知抗病毒功能的核心ISG的14个亚群（图2B）。接下来，利用MeRIP-seq数据生成了IFITM1、MX1、ISG15和EIF2AK2图，并使用m6A peaks calling 方法MeTDiff和meRIPPer揭示METTL3/14调节基因IFITM1和MX1具有m6A peaks（图2C和2D），而ISG15和EIF2AK2没有m6A peaks（图2E和2F），这些图表明ISG15的3\'UTR也可能包含m6A位点（图2E）。将MeRIP-seq实验中ISG的m6A状态与已发表的研究数据进行比较，比较结果显示在所有研究中核心抗病毒ISG的m6A状态预测一致。dsDNA处理有效地激活IFN产生并诱导本实验中发现的相同核心抗病毒ISG的m6A修饰。HCMV感染也导致某些ISG的m6A修饰，这种病毒编码抑制IFN信号因子；因此ISG可能不像dsDNA或IFN-β处理那样强烈诱导。m6A在许多ISG上的存在表明m6A可以调节抗病毒I型IFN响应。

图2：METTL3/14调节的ISG由m6A修饰

（A） 在IFN-β处理（8h）后，转录组范围内的m6A分布Metagene图，绘制了具有统计学意义的peaks 中DRACH motif位点相对位置，以及peaks中最富集的motif。

（B） 在表达的转录组中由m6A修饰的基因百分比，响应于IFN-β处理（ISG）的mRNA诱导≥4倍的基因，脊椎动物中保守的核心ISG，或具有抗病毒功能的核心ISG亚群。

（C-F）在IFITM1（C）、MX1（D）、ISG15（E）和EIF2AK2（F）转录本中MeRIP（红色）和input（黑色）reads覆盖图。生物学重复的差异由reads覆盖范围周围的红色和黑色阴影表示，灰色阴影表示编码序列，黄色阴影表示由MeTDiff和meRIPPer的m6A peaks calling软件。所有分析均在3个生物学重复上进行。

 

（3）IFITM1在3′UTR中的m6A修饰增强了其翻译

m6A增强了某些mRNA的翻译。具体而言，m6A识别蛋白（readers）YTHDF1在3′UTR内识别m6A，并与真核翻译起始因子（如eIF3）结合，以增强m6A修饰转录本的翻译。为METTL3/14对ISG的翻译调节是否是通过m6A诱导，研究使用IFITM1作为METTL3/14调节的ISG模型。首先确定METTL3/14缺失对IFITM1 m6A修饰的影响。MeRIP-qRT-PCR结果表明IFITM1 mRNA在m6A阴性ISG EIF2AK2和m6A阴性合成RNA中富集，证实其含有m6A。METTL3/14缺失降低了IFITM1 mRNA的m6A富集，但没有降低m6A阴性EIF2AK2转录本或m6A阴性合成RNA的富集（图3A和3B），数据表明IFITM1是由METTL3/14修饰的m6A。

图3：IFITM1在 3\'UTR中的m6A修饰增强了翻译

（A） 在用siCTRL或METTL3/14 siRNA处理并掺入m6A阴性（NEG）寡核苷酸的Huh7细胞中，由IFN-β（8h）诱导的ISG的相对m6A水平的代表性MeRIP qRT-PCR分析。

（B） A中5个生物学重复每个基因的相对富集百分比，归一化为siCTRL。

（C） 野生型（WT）和突变型ISRE-m6A缺失的Renilla荧光素酶（R-Luc）IFITM1 3\'UTR报告基因示意图，该报告基因也从单独的启动子表达m6A缺失的萤火虫荧光素酶（F-Luc）。

（D）经IFN-β（8h）处理的转染Huh7细胞的WT和m6A-mut IFITM1 3\'UTR报告RNA的相对m6A水平的MeRIP-qRT-PCR分析。

（E）用siRNA转染的Huh7（24h）、然后进行报告基因转染（24h）和用IFN-β处理（8h）的WT和m6A-mut IFITM1 3\'UTR报告基因RNA的相对m6A水平的MeRIP-qRT-PCR分析，。

（F） 报告基因转染（24h）和IFN-β处理（8h）后，在Huh7细胞中归一化为HPRT1的WT和m6A-mut IFITM1 3\'UTR报告基因mRNA表达的qRT-PCR分析。

（G） IFN-β诱导的WT和m6A-mut IFITM1 3′UTR报告基因中的相对萤光素酶活性（R-Luc/F-Luc）（相对于模拟8h）。

在鉴定出IFITM1是m6A修饰之后，接下来生成了一个荧光素酶报告基因，其中包含IFN刺激的响应元件（ISRE）-启动子驱动的Renilla萤光素酶，所有DRAC motif被敲除（m6A-null R-Luc），然后与野生型（WT）IFITM1 3′UTR或类似的3′UTR序列结合，IFITM1中3′UTR m6A peaks中的四个推定m6A motif从A→G转换（m6A-mut）（图3C）。分析数据结果表明， METTL3/14通过向3\'UTR添加m6A修饰来调节IFITM1翻译，并且IFITM1 3\'UTR内的m6A修饰足以增强其翻译。

 

（4）YTHDF1以m6A依赖性方式增强IFITM1蛋白表达

为检测YTHDF1是否诱导m6A对ISG的翻译促进作用，研究人员在Huh7细胞中稳定过表达YTHDF1（H7Y1）或m6A结合缺陷型YTHDF1蛋白（H7Y1mut）并分析其相对于亲本Huh7细胞（H7）在24h后IFN诱导的ISG表达。YTHDF1过表达增加响应IFN-β的IFITM1蛋白表达，而m6A结合缺陷型YTHDF1蛋白（H7Y1mut）的过表达不增加IFITM1丰度（图4A和4B）。且野生型（WT）和突变型YTHDF1过表达不会显著影响IFN-β处理后的IFITM1 mRNA水平，表明YTHDF1不直接调控IFN信号或IFITM1 mRNA稳定性（图4C）。YTHDF1过表达显著改变IFN诱导的含m6A的ISG MX1表达，或不含m6A的ISG ISG15和EIF2AK2表达（图4A和4B）。而在IFN-β处理后，YTHDF1缺失会导致IFITM1蛋白表达降低，但MX1、ISG15和EIF2AK2未受影响（图4D）。另外，WT YTHDF1与IFITM1、MX1、ISG15和m6A阳性对照SON的转录本结合，而m6A结合缺陷型YTHDF1突变蛋白则没有结合。含有非m6A的mRNA EIF2AK2和RPL30不与任一蛋白结合（图4E和4F）。总之，这些结果表明YTHDF1与IFITM1 mRNA上的m6A结合，且通过其m6A结合活性增强其翻译是必要和充分的。YTHDF1与ISG15 mRNA明显的m6A依赖性结合表明ISG15 mRNA实际上是m6A修饰。在ISG15 mRNA的input reads与MeRIP-seq reads的关联图揭示了其3\'UTR中m6A富集的潜在区域（图2E）。因此，YTHDF1在促进翻译中具有转录本特异性作用，因为它结合了IFITM1、MX1和ISG15的转录本，但其过表达仅足以显著增加IFITM1的蛋白生成。

图4：YTHDF1以m6A依赖性方式增强IFITM1蛋白表达

（A） 在模拟或IFN-β（24h）处理后稳定过表达FLAG-YTHDF1 WT（Huh7Y1）或FLAG-YTHDF1 W465A（Huh7Y1mut）的Huh7细胞提取物的免疫印迹分析。

（B） A的3个独立实验中IFN-β处理后ISG表达定量，归一化为总蛋白并相对于siCTRL绘图。

（C） 在IFN-β（24h）处理后稳定过表达FLAG-YTHDF1 WT（Huh7Y1）或W465A（Huh7Y1mut）的Huh7细胞中归一化为HPRT1的ISG mRNA表达的qRT-PCR分析。

（D） 在模拟或IFN-β（24h）处理之前，用siRNA转染YTHDF1（siY1）或siCTRL的Huh7细胞提取物的免疫印迹分析。数据代表3个独立的生物学实验。

（E） 与IFN-β（8h）处理后Huh7细胞的FLAG-GFP相比，FLAG-YTHDF1 WT（Y1）或W465A（Y1mut）的免疫沉淀（IP）后mRNA富集的qRT-PCR分析。将IP值归一化为input值并绘制为GFP的倍数富集。

（F） E中使用的FLAG免疫沉淀和input级分的免疫印迹分析。

 

（5）METTL3/14和m6A促进ISG亚群的翻译

为鉴定蛋白表达受METTL3/14调节的其他ISG，使用基于定量质谱的蛋白质组学和氨基酸稳定同位素标记（SILAC）来比较IFN-β处理后siCTRL和siMETTL3/14细胞的蛋白质组。与siCTRL相比，siMETTL3/14对蛋白丰度的影响集中在大多蛋白质的对数比为0，表明METTL3/14缺失对IFN-β处理后的蛋白质水平没有整体影响。在先前的RNA-seq实验中，将ISG定义为通过IFN-β处理上调>2倍的基因来确定哪些蛋白是ISG。尽管质谱法检测ISG有限（n=18），但鉴定出一些METTL3/14调节的ISG（图5A；MS）。METTL3/14缺失后，大多数这些ISG的蛋白表达降低，且这些ISG包括先前鉴定的m6A修饰的IFITM1（对应于IFITM1/2/3的肽）和MX1，以及其他抗病毒ISG如OAS2和不同的HLA-C链（图5A），均由m6A修饰。通过将这些数据与之前的RNA-seq实验数据进行比较，结果表明METTL3/14对这些ISG蛋白水平的影响不由其mRNA表达调节来确定，因为METTL3/14缺失后，本实验中在蛋白水平上降低的ISG的mRNA丰度没有降低，表明翻译调控如先前对IFITM1和MX1的多核糖体分析所表明结果一致（图1C和1D；图5A，RNA）。并非所有通过质谱法鉴定的m6A修饰的ISG都受METTL3/14缺失调节（图5A；m6A），表明METTL3/14和m6A调节ISG的亚群并支持其蛋白表达。

图5：METTL3/14调节ISG亚群的翻译

（A） 3列热图显示了IFN-β处理后METTL3/14缺失对Huh7细胞中ISG表达的影响。第一列显示定量质谱法检测蛋白质估计值的log2倍变化（siMETTL3/14与siCTRL + IFN-β 24 h；n=2个生物学重复）。第二列显示独立RNA-seq实验（siMETTL3/14与siCTRL + IFN-β 8 h；n=3个生物学重复）的mRNA reads的log2倍变化。第三列显示MeRIP-seq数据的m6A状态（+表示m6A阳性；-表示m6A阴性）（+IFN-β 8h；n=3个生物学重复）。基因包括RNA-seq的IFN诱导超过2倍的任何ISG，这些ISG也可以通过质谱法检测到，其他图中的ISG以粗体显示。由于IFITM1/2/3相似，因此使用此表示法表示从该蛋白质家族中检测到的肽；RNA-seq倍数变化和m6A状态对应于带下划线的数字，调整后*p<0.05。

（B） METTL3/14缺失对ISG表达影响的四象限散点图。y轴是Ribo-seq的核糖体保护片段的log2倍变化（siMETTL3/14超过siCTRL），x轴是来自独立RNA-seq实验的mRNA读数的log2倍变化（siMETTL3/14与siCTRL）。m6A修饰（蓝色）或m6A阴性（灰色）基因。对其他图中的ISG进行了标记。

 

（6）METTL3/14增强了IFN响应的抗病毒作用

METTL3/14在I型IFN响应期间增强ISG亚群表达，表明它可能是最佳抗病毒所必需。研究人员检测了METTL3/14动态变化后I型IFN限制负义链RNA病毒水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）感染的能力。VSV基因组包含了m6Am帽修饰，但由于这种修饰沉积不受METTL3/14调控，因此VSV复制可能不会受到METTL3/14动态变化的直接影响，而对VSV复制的任何影响可能由宿主转录本的甲基化介导。通过使用小干扰RNA（siRNA）或过表达来干扰METTL3/14的表达，然后使用显微镜在存在和不存在低剂量IFN-β预处理（6h；40U/mL）的情况下，检测感染后6小时被VSV感染的细胞百分比。在感染后早期时间点检测VSV感染，可以在感染直接诱导的ISG细胞上调之前检测到病毒复制。结果显示，在没有IFN-β预处理的情况下，任何条件下都没有看到VSV诱导ISG（图6A和6B）。通过免疫印迹或定量感染细胞百分比分析来检测VSV复制，在没有IFN-β处理情况下，METTL3/14缺失或过表达没有变化（图6）。在IFN-β预处理后，METTL3/14缺失导致METTL3/14调节的ISG表达降低（图6A），而METTL3/14过表达则上调其表达（图6B）。尽管IFN-β预处理减少了VSV病毒复制，但METTL3/14缺失降低了IFN-β限制VSV的能力，而METTL3/14过表达则会增强IFN介导的VSV限制（图6）。总之这些数据表明METTL3/14增强了I型IFN的抗病毒特性，是有效IFN介导的抗病毒响应所必需的。

图6：METTL3/14增强了I型IFN响应的抗病毒作用

（A-B） 用siRNA（A）转染或稳定过表达FLAG-METTL14的Huh7细胞提取物的代表性免疫印迹分析（n=3），其也增强METTL3表达（M3/14OE）；用IFN-β（6h）或模拟物处理，然后进行VSV感染（MOI=2；6h）（B）。箭头表示FLAG-METTL14（上）和内源性METLL14（下）。

（C-D） 用siCTRL或METTL3/14 siRNA（C）或稳定过表达FLAG-METTL14（METTL3/14OE；D）处理的Huh7细胞的代表性显微图，这些细胞用IFN-β预处理（6h），然后进行VSV感染（MOI=2；6h），对3个独立实验感染的细胞百分比进行定量，每个条件5个视野，每个视野>150个细胞，归一化为未经IFN处理的siCTRL或WT，如右图所示。比例尺：100μm。

 

关于易基因RNA m6A甲基化测序(MeRIP-seq)技术

易基因MeRIP-seq技术利用m6A特异性抗体富集发生m6A修饰的RNA片段（包括mRNA、lncRNA等rRNA去除所有RNA），结合高通量测序，可以对RNA上的m6A修饰进行定位与定量，总RNA起始量可降低至10μg，最低仅需1μg总RNA。广泛应用于组织发育、干细胞自我更新和分化、热休克或DNA损伤响应、癌症发生与发展、药物响应等研究领域；可应用于动物、植物、细胞及组织的m6A检测。

大样本量m6A-QTL性状关联分析，传统MeRIP单个样品价格高，通常难以承担。易基因开发建立MeRIP-seq2技术，显著提成IP平行性，实现不同样本间相对定量，降低检测成本。

易基因提供适用于不同科研需求的MeRIP技术：

• m6A甲基化-常量mRNA 甲基化测序（MeRIP-seq）
• m6A甲基化-常量mRNA +lncRNA甲基化测序（lnc-MeRIP-seq）
• m6A甲基化-微量mRNA +lncRNA甲基化测序（Micro-lnc-MeRIP-seq）
• 高通量m6A甲基化-常量mRNA甲基化测序（MeRIP-seq2）

技术优势：

• 起始量低：样本起始量可降低至10-20μg，最低仅需1μg总RNA；
• 转录组范围内：可以同时检测mRNA和lncRNA；
• 样本要求：可用于动物、植物、细胞及组织的m6A检测；
• 重复性高：IP富集重复性高，最大化降低抗体富集偏差；
• 应用范围广：广泛应用于组织发育、干细胞自我更新和分化、热休克或DNA损伤响应、癌症的发生与发展、药物响应等研究领域。

研究方向：

m6A甲基化目前主要运用在分子机制的理论性研究

• 疾病发生发展：肿瘤、代谢疾病（如肥胖/糖尿病）、神经和精神疾病（如阿尔兹海默症/抑郁症）、炎症…
• 发育和分化：早期胚胎发育、个体/组织/器官生长发育、干细胞分化与命运决定、衰老
• 环境暴露与响应：污染、抗逆、生活方式

关于m6A甲基化研究思路

（1）整体把握m6A甲基化图谱特征：m6A peak数量变化、m6A修饰基因数量变化、单个基因m6A peak数量分析、m6A peak在基因元件上的分布、m6A peak的motif分析、m6A peak修饰基因的功能分析

（2）筛选具体差异m6A peak和基因：差异m6A peak鉴定、非时序数据的分析策略、时序数据的分析策略、差异m6A修饰基因的功能分析、差异m6A修饰基因的PPI分析、候选基因的m6A修饰可视化展示

（3）m6A甲基化组学&转录组学关联分析：Meta genes整体关联、DMG-DEG对应关联、m6A修饰目标基因的筛选策略

（4）进一步验证或后期试验

易基因科技提供全面的RNA甲基化研究整体解决方案。

参考文献：

McFadden MJ, McIntyre ABR, Mourelatos H, Abell NS, Gokhale NS, Ipas H, Xhemalçe B, Mason CE, Horner SM. Post-transcriptional regulation of antiviral gene expression by N6-methyladenosine. Cell Rep. 2021 Mar 2;34(9):108798.

 

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易基因： oxRRBS+RRBS揭示炎症性肠病导致发育异常的表观遗传机制｜甲基化研究

大家好，这里是专注表观组学十余年，领跑多组学科研服务的易基因。

2020年12月31日，美国明尼苏达大学Natalia Y. Tretyakova教授团队在《Int J Mol Sci》杂志发表题为“Multi-Omics Characterization of Inflammatory Bowel Disease-Induced Hyperplasia/Dysplasia in the Rag2-/-/Il10-/- Mouse Model”的研究文章，该研究通过简化基因组甲基化测序（RRBS）+氧化简化基因组甲基化测序（oxRRBS）及对应的转录组测序（RNA-seq）揭示炎症性肠病 (IBD)导致基因组中甲基化和羟甲基化模式变化，表明了IBD导致发育异常的表观遗传机制。

标题：Multi-Omics Characterization of Inflammatory Bowel Disease-Induced Hyperplasia/Dysplasia in the Rag2-/-/Il10-/- Mouse Model （Rag2-/-/Il10-/-小鼠模型中炎症性肠病诱导增生/发育异常的多组学表征）

时间：2020-12-31

期刊：International Journal Of Molecular Sciences

影响因子：IF 6.208

技术平台：RRBS、oxRRBS、RNA-seq、RT-qPCR等

 

研究摘要：

假设表观遗传失调在炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）和结肠癌发展之间的关联中发挥作用。本研究对从肝螺杆菌（H.hepaticus）感染的IBD小鼠模型中收获近端结肠组织，并进行DNA甲基化组、DNA羟甲基化组和转录组分析。RRBS和oxRRBS分析共鉴定出1606个差异甲基化区域（DMR）和3011个差异羟甲基化区域（DhMR），与胃肠疾病、炎性疾病和癌症相关的基因和这些DMR/DhMR重叠。RNA-seq揭示了许多与炎症和癌症相关的基因显著表达变化，包括Duox2、Tgm2、Cdhr5和Hk2在内的几个基因在DNA甲基化/羟甲基化和基因表达水平上均表现出变化。总体而言，本研究结果表明，慢性炎症会引发基因组中DNA甲基化和羟甲基化模式的变化，从而改变关键肿瘤发生基因的表达，并可能导致结直肠癌的发生。

 

项目设计：

（1）样本选取：

IBD与正常小鼠近侧肠道组织的5mC、5hmC、表达图谱分析

（2）项目设计流程图：

 

实验结果

（1）肝螺杆菌（H. hepaticus）感染的Rag2-/-/Il10-/-小鼠结肠组织的组织病理学分析

图1：炎症性肠病（IBD）与正常组织的组织病理学检验

1. 动物研究设计：Rag2-/-/Il10-/-小鼠在6-7周龄时H.hepaticus感染或无菌培养基处理（对照），并在感染后20周处死
2. 感染H.hepaticus（橙色）的Rag2-/-/Il10-/-雄性小鼠和仅用盐水处理的对照小鼠（蓝色）的结肠组织的组织病理学结果：通过对胃肠道不同部位的炎症、水肿、上皮缺陷、隐窝萎缩、增生和发育异常（Dysplasia）的个体评分求和来计算组织学活性指数（n=7）
3. 感染或未感染H.hepaticus的Rag2-/-/Il10-/-雄性小鼠胃肠道不同部位的整体5-甲基胞嘧啶（5mC）水平，（盲肠每组n=4，横结肠每组n=3，近端和远端结肠每组n=7）
4. 感染或未感染H.hepaticus的Rag2-/-/Il10-/-雄性小鼠胃肠道不同部位的整体5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）水平

 

（2）炎症性肠病（IBD）诱导的增生/发育异常中DNA甲基化和DNA羟甲基化表征

图2：差异甲基化区域（DMR）和差异羟甲基化区域（DhMR）富集的基因在与癌症发生和胃肠疾病相关的基因富集。

1. RRBS和oxRRBS技术示意图：通过比较RRBS和oxRRBS数据集分析5mC和5hmC水平。

B-C. 通过RRBS与oxRRBS结合鉴定1606个DMR（B）和3011个DhMR（C）的热图。

D-E. 通过Ingenuity Pathway Analysis（IPA），使用显著性阈值p=0.05的Fisher精确检验，预测受DMR（D）和DhMR（E）基因影响的功能和疾病。

 

（3）差异甲基化分析揭示IBD诱导的增生/发育异常中存在广泛的DMR和DhMR

图3：Rag2-/-/Il10-/-小鼠在H.hepaticus诱导炎症在单核苷酸分辨率下的甲基化和羟甲基化动态变化

1. 784个低DMR，822个高DMR，1454个低DhMR和1557个高DhMR的基因组分布饼图
2. DMR/DhMR内每个CpG位点5mC和5hmC的动态变化。0.1是5mC/5hmC水平显著性变化的截止值。数字代表点数量。

表1：H.hepaticus诱导的Rag2−/−/Il10−/−小鼠炎症CpG位点IPA差异甲基化和羟基甲基化的经典通路

 

（4）IBD诱导增生/发育异常中的基因表达变化

图4：炎症性肠病（IBD）和对照小鼠中近端结肠的转录组分析

1. 基于最高方差的500个基因的无监督分层聚类，显示对照组和IBD组之间明显分离
2. IPA鉴定上游调控因子Il10ra周围的网络
3. 使用显著性阈值p=0.05的Fisher精确检验，预测受差异表达基因影响的疾病和功能

 

（5）DNA甲基化异常调控差异表达基因的综合分析

图5：IBD诱导的转录组、DNA甲基化组和羟甲基化组变化之间的相关性

A-B. 差异表达且DMR（A）或DhMR（B）富集的基因散点图。颜色表示不同基因组表征，点大小表示每个区域的CpG数量。

1. DNA表观遗传标记在IBD诱导的结直肠癌（CRC）发生中的作用的模型。

 

总结：

本研究采用RRBS+oxRRBS在H.hepaticus感染的IBD Rag2-/-/Il10-/-小鼠模型中，分别绘制了IBD诱导的DNA羟甲基化和DNA甲基化在全基因组中的变化。同时结合RNA-seq基因表达分析，研究结果首次全面揭示了结肠炎症诱导的表观遗传学变化，为进一步研究IBD生物标志物的发现提供了有用的信息，并有可能促进IBD新疗法的未来发展。

 

关于易基因精准DNA甲基化/羟甲基化测序（oxBS-seq）

羟甲基化5hmC是哺乳动物基因组上的第六碱基，在发育、衰老、神经退行性疾病、复杂疾病及肿瘤发生过程中起重要作用。DNA羟甲基化是近年发现的一种新的DNA修饰并迅速成为研究热点。随着研究的深入，发现之前被认为是检测DNA甲基化标准的重亚硫酸盐测序并不能区分DNA甲基化（5mC）和DNA羟甲基化（5hmC）。

易基因联合剑桥大学建立了化学氧化法结合重亚硫酸盐转化的测序技术（oxidative bisulfite sequencing, oxBS-Seq），该技术不仅可以精确检测DNA甲基化，排除DNA羟甲基化的影响，还可以双文库结合同时单碱基分辨率精确检测DNA羟甲基化。

传统BS转化无法区分5mC和5hmC

传统的Bisulfite测序中，5hmC经过Bisulfite处理后变为CMS，CMS在测序中仍然被读作C碱基，因此不能区分5mC和5hmC。

oxBS技术原理

技术优势：

• DNA甲基化检测全新的“标准”；
• 单碱基检测DNA羟甲基化修饰；
• 多重质控标准检测氧化效率和Bisulfite转换率；
• 实验偏好性低，重复性高（R2＞0.98）；
• 易基因自主研发的甲基化特异性多重PCR引物设计软件；
• 可满足多种测序应用需求：
• 全基因组氧化甲基化测序（oxWGBS）
• 简化基因组氧化甲基化测序（oxRRBS）
• 目标区域靶基因氧化甲基化测序（Target-oxBS）。

技术路线：

技术指标：

易基因科技提供全面的DNA甲基化研究整体解决方案，技术详情请致电易基因。

参考文献：

Han Q, Kono TJY, Knutson CG, Parry NM, Seiler CL, Fox JG, Tannenbaum SR, Tretyakova NY. Multi-Omics Characterization of Inflammatory Bowel Disease-Induced Hyperplasia/Dysplasia in the Rag2-/-/Il10-/- Mouse Model. Int J Mol Sci. 2020 Dec 31;22(1) pii: ijms22010364.

 

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