怎样构建人的基因文库它的原理是啥

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篇首语：本文由小常识网(cha138.com)小编为大家整理，主要介绍了怎样构建人的基因文库它的原理是啥相关的知识，希望对你有一定的参考价值。

使用限制酶将人体DNA中的基因分别切下，再将每个基因用质粒作为载体导入细菌体内，这样就可以得到人体的基因文库，构建基因文库用到了很多技术，原理应该是基因重组
部分基因文库是通过反转录所得到的，其原理应该是碱基互补配对原理来自：求助得到的回答 参考技术A 简单的说，就是把表达的mRNA先反转录为cDNA，再形成双链DNA，然后克隆到质粒。转染细菌后，得到克隆。涂盘后，每个菌落代表一个克隆，也就是一个基因

评估文库 Average Insert Size

原文引用https://www.dazhuanlan.com/2019/08/25/5d625e390b317/


用SOAPdenovo对Illumina paired-end进行基因组组装时需要配置文档，其中要填写每个文库的average insert size，那么如何进行average insert size大小的评估呢？

文库类型

对于基因组文库我们一般会建小库（<1K）的paired-end reads和大库的mate-pair reads，二者最主要的区别就是reads1和reads2的方向和之间的间隔大小。

技术图片

现在绝大部分的主流软件都是支持将paired-end reads进行比对的，那么 mate-pair reads如何处理呢，即 mate-pair reads如何做比对？请参考我的另一篇博文 Mate-pair Reads Alignment

Insert Size

首先，什么是Insert Size呢？
对于paired-end reads来说
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对于mate-pair reads来说其reads1和reads2方向指向外面，其插入大小统计需要格外注意。

基于bwa比对log文档统计插入大小

通过观察bwa软件的输出log文档发现其对每一个pair-end reads分4次读入（[M::main_mem] read 2613712 sequences (200000105 bp)…），对于每一次的读入会对reads进行统计如下：
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由红框标出发现占主要比例的是RF reads，进一步往下寻找analyzing insert size distribution for orientation RF…就可得到其平均插入大小。

基于比对的sam文档统计插入大小

R计算

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$ cat sample.sam | cut -f9 > initial.insertsizes.txt
R
a = read.table("initial.insertsizes.txt")
a.v = a[a[,1]>0,1]                     
mn = quantile(a.v, seq(0,1,0.05))[4]   
mx = quantile(a.v, seq(0,1,0.05))[18]  #85%
mean(a.v[a.v >= mn & a.v <= mx])       # mean
sd(a.v[a.v >= mn & a.v <= mx])         # sd

可见R计算过程选择过滤掉小于等于15%和大于等于85%的值来计算平均插入大小；

awk计算

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awk ‘ if ($9 > 0)  N+=1; S+=$9; S2+=$9*$9  END  M=S/N; print "n="N", mean="M", stdev="sqrt ((S2-M*M*N)/(N-1))‘ sample.sam

awk选择全部大于0的值计算平均插入大小；

基于sorted.bam文档

qualimap

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qualimap bamqc -bam sample.sorted.bam --java-mem-size=300G  -c -nw 400 -hm 3 -outdir /resulted

CollectInsertSizeMetrics

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java -jar CollectInsertSizeMetrics.jar 
      I=sample.sorted.bam 
      O=insert_size_metrics.txt 
      H=insert_size_histogram.pdf 
      M=0.5

问题

现对同一个比对产生的sam/bam文档用上述4种方法计算得出结果如下：
R ：mean insert size = 260.577232343453”，”standard deviation = 27.4153198790634”；
awk： mean=250.826, stdev=51.7005；
qualimap：mean insert size = 250.8258，std insert size = 51.7005；
CollectInsertSizeMetrics：MEAN_INSERT_SIZE=260.963523，STANDARD_DEVIATION=42.809159。
qualimap 和 CollectInsertSizeMetrics 都是java封装的软件，看不到其具体计算方法，根据以上计算结果可以看出CollectInsertSizeMetrics的计算原理应该和R的一样需要过滤掉数据，qualimap和awk中发一样，所以问题最后就归结为是否需要首先过滤数值再计算平均插入大小？
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在R中计算时对数据a.v做正态性检验lillie.test(a.v)

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> library("nortest")
> lillie.test(a.v)

        Lilliefors (Kolmogorov-Smirnov) normality test

data:  a.v
D = 0.1541, p-value < 2.2e-16

可以看出其插入大小分布不是呈正态分布，综合考虑后还是按照R的计算结果为准。

参考资料

Question: Estimate Insert Size In Paired-End/Mate-Pair
Question: What is the difference between a Read and a Fragment in RNA-seq?
Paired-end read confusion - library, fragment or insert size?

以上是关于怎样构建人的基因文库它的原理是啥的主要内容，如果未能解决你的问题，请参考以下文章

构建基因文库的目的和意义？

为啥构建基因文库？直接从生物体内提取不行吗

基因组文库名词解释

基因组 de novo 组装原理

Illumina测序原理

基因组组装中的pipeline是啥意思