edgeR的一些小九九

Posted 2023-03-14

参考技术A

基本上RNA-Seq等等各种测序手段都需要计算差异表达
通常大家常用的软件不外乎cufflinks和几个R包DESeq、EBSeq、edgeR、ballgown。
值得一提的是现在的软件和R包大多需要有 生物学重复 才能准确计算差异表达情况

目前，我只了解edgeR可以在无生物学重复的情况下计算差异表达。

edgeR 官方发布页[中科大镜像]： http://mirrors.ustc.edu.cn/bioc/packages/release/bioc/html/edgeR.html

首先，安装edgeR包

随后，读取数据，修饰成如图的模样，列名自己随意定义能够识别对应什么样本就好，行名需要为对应的转录本或者基因的可识别的ID或者名称

以上，即完成了无生物学重复的差异表达的计算

结果中，有三列

补充，CPM（count per million）CPM = 每个转录本的count值/某样本总count值 * 10^6

如果，还需要计算q值，自行通过R的p.adjust计算一下就好
results$q = p.adjust(results$PValue, method = \'fdr\')

edgeR

edgeR:Empirical Analysis of Digital Gene Expression Data in R

一个R包，用于RNA-seq或相关技术分析中，基因差异性表达的read count的分析。(read count 已通过HTseq-count等工具得到)。

read counts的来源可以htseq-count等计算原始count的结果，不可以是cufflinks等计算normalization count的结果。

 counts数据格式：至少为两列，一列为基因类表，一列为raw counts。如果数据存储在不同的文件中，则应该将其合并。可以用readDGE函数。

 

 edgeR是以DEGList的格式储存数据，DEGList是一个以list为基础的数据格式，list的所有方法其都可以使用。

1.构建DEGList：用DEGList（）构建。

>y<-DGEList(counts=x)  #x是read counts的matrix或data.flame。
>group<-c(1,1,2,2)    #关于sample属于哪一个group。
>y<-DGEList(counts=x,group=group) 

 DEGList中主要包括一个counts matrix，一个 samples data.frame,还有一个可选的genes data.frame（注释）。

sample data.frame 主要包括library的size或sample的sequencing depth，如果没给，则会默认按counts的总和来计算。但是必须 sample data.frame必须包含一个列group，用于区分samples属于哪一个group。

 

2。过滤：

生物学上看，一个基因要被表达成蛋白或是其他的生物功能，则它的表达量应该达到一个最低的水平。
所以在进一步分析前，应该过滤掉一些low counts的基因。这里用cpm（count per million)来表示基因的counts水平。

>keep<-rowSums(cpm(y)>1)>=2  #>=2表示每个group中的samples数最少是2.
>y<-y[keep, ,keep.lib.sizes=FALSE]

 

3.TMM标准化：

在treated和untreated样品中，常常会有少量的基因在treated样品中高表达，但在untreated样品则正常。在treated样品中，高表达的基因的reads会占据一大部分的library size，

而导致剩余基因被错误的判断为下调。

>y<-calcNormFactors(y)
>y$samples

 

4.离散度的检测(dispersion)

design<-model.matrix(~group)

y<-estimateGLMCommonDisp(y,design,verbose=TRUE)

y<-estimateGLMTrendedDisp(y, design)

y<-estimateGLMTagwiseDisp(y, design)

 

5.差异性基因分析

to perform quasi-likelihood F-tests:

fit <- glmQLFit(y,design)

qlf <- glmQLFTest(fit,coef=2)

topTags(qlf)

 

to perform likelihood ratio tests:

fit<-glmFit(y, design)

lrt<-glmLRT(fit)

topTags(lrt)#前10个差异表达基因，内容分别为：genes:logFC:logCPM:F:PValue:FDR

#FC:fold change,，一般取两个样本的比值的均值，由于两个样本之间差异过大，为了缩小数值之间的差异，做对数转换。

P VALUE:统计学检验变量，代表差异显著性，一般认为p值小于0.05代表具有显著性差异。

 

 参考：

http://blog.sina.com.cn/s/blog_5d188bc40102vwci.html

http://blog.sciencenet.cn/blog-508298-776802.html