差异表达edgeR，limma（上）

Posted 2023-03-14

参考技术A 为了方便起见，直接选用 airway 的数据作为训练数据

使用 symbol_id 为y命名，并对重复的 symbol_id 与 ensembl_id 结合以防止重复id

进行后续处理一般都不会用raw counts的，因为存在测序深度、文库大小的差别，这样的结果是不准确的
一般的做法是：利用标准化算法，如CPM（counts per million), log-CPM (log2-counts per million), RPKM (reads per kilobase of transcript per million), FPKM(fragments per kilobase oftranscript per million)等去除文库大小、深度的影响。和RPKM、FPKM不同的是，CPM和log-CPM不需要考虑feature length的差异，也就是说基因长度在统计时被当成常数，只考虑不同处理下的不同，而不会受长度的影响

cpm使用 cpm() 函数；RPKM使用 rpkm 函数，都属于edegR

所有数据集都会存在一些检测不到的基因或者表达很少的基因，这些基因对于后续分析来说不仅对结果没有影响，还会增加下游分析的计算量，所以我们需要设计一定的阈值将这些基因去除

首先看一下表达量为0的基因

过滤基因：标准就是lcpm在所有样本表达量的平均值大于0,也就是cpm大于1

对于 edgeR 来说，进行差异表达时为什么需要counts矩阵呢，因为 edgeR 有自己的标准化步骤， edgeR 使用TMM（trimmed mean of M-values）算法，利用edgeR中函数 calNormFactors()

标准化用到的normalisation factors 就在DEGList中的 x$samples$norm.factors

如何检查是否标准化，可以做一个箱线图显示