学基因之illumina介绍

Posted 2020-10-05 5号平凡的我

illumina技术：

　　工具：flowcell(流动池)：8通道，每个通道都有 2种DNA引物 种在玻璃表面(用共价键连到Flowcell上)，这引物和文库中的接头互补

　　　　    Flowcell：8个line，，line：上下两个表面，，面：3个扫描通道swath，，swath：16个方块tile

　　文库制作：超声打断DNA，用酶补平，用Klenow酶加碱基，用连接酶 在双端 加特定接头，形成DNA混合物 称为DNA文库。

　　　　特点1，中间为待测序列；

　　　　特点2，两端接头序列人工加上去，已知，大有文章可做。

　　桥式PCR：把文库种到芯片上，扩增

　　　　种文库：引物接头互补，会互补杂交，完成种文库。加入dNTP和酶  沿着作为模板的文库 生成一条新DNA链，与要测的链完全互补。

　　　　　　　　加NaOH碱溶液，解链，冲走文库模板链，留下刚生成的链(因为其长在芯片上)，加中和液，弯曲 接头另一端与芯片上另一种引物互补杂交

　　　　扩增：加入dNTP和酶 ，合成出一条新链，加碱解链，加中和液中和，弯曲互补杂交，，，重复之。。

　　制备单链：通过把其中一个引物上一个特定集团切掉，加碱解链，水冲，只留一半的 某一种引物连接DNA链，

　　正式测序：加入两种东西，一是带荧光标记的dNTP，其3‘端堵住了；二是聚合酶。每次只能加上一个碱基，后停止。水冲。激光扫描 推断碱基。这个推断的与要测的片段完全一致，都是与芯片上的模板互补的。

　　　　　　    一个循环后，加入化学试剂，切掉3‘叠氮集团和荧光集团。。下一轮……

　　index (即barcode)：每个样本有特定的接头，每个接头里有一段特定序列——index。用于标记样本的来源。

　　　　　　　先把测完序的Read1解链掉，加入中性液，，加入Read2引物  这个引物就在index序列旁，开始第二轮测序 读取index，一般6-8bp

　　双端测序：正向读一遍，从另一个方向再读一遍。方法：先用桥式合成一个互补链，后把自己切掉，冲走，让互补链再测长度的另一半。

　　　　　　　解答：本链在芯片上，互补链是从上到下(3‘-->5‘)方向合成 测序，，，，桥式合成互补链后，互补链的上端种在芯片上 成了下端，

 　　　　　　　　　　　　　　　　  互补链从下到上(3‘-->5‘)，那用它测序时 还是从上到下(3‘-->5‘)，与原来方向一致 3‘-->5‘也不违背。只是base calling时要取互补。

 

　　phasing 和 prephasing：每次反应，各种原因，总有少量分子没有完成参加反应，下次反应时发的荧光就与大部队不一样，形成噪音；或遇到一个3‘没有叠氮集团的碱基 一次加入了两个碱基，就超前了，又是噪音。

　　chastity 和 Pass filter：对荧光纯粹程度的描述。Chastity的定义，就是浓度最高的那个荧光素的量，除以浓度第二的荧光量，》=1.5，则为好碱基。

　　　　　　　　　　　　  对每个read的质量都要做一个叫“pass filter”的检验。看前25个碱基当中，如果只有一个、或者没有坏碱基，则Pass filter就通过；如果有超过一个以上的坏碱基，Pass filter就不能通过。