易基因：多组学关联分析及组学分子实验验证方法（表观组+转录组+微生物组）｜干货系列

Posted 2023-05-16 E-GENE

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篇首语：本文由小常识网(cha138.com)小编为大家整理，主要介绍了易基因：多组学关联分析及组学分子实验验证方法（表观组+转录组+微生物组）｜干货系列相关的知识，希望对你有一定的参考价值。

大家好，这里是专注表观组学十余年，领跑多组学科研服务的易基因。

生物过程具有复杂性和整体性，单组学数据难以系统全面解析复杂生理过程的分子调控机制。而多组学（Multi-omics）联合分析可同时实现从“因”和“果”两个层面研究生物学问题，并对其相关性进行验证。高通量技术的发展，通过对多组学数据整合分析，已成为科学家探索生命机制的新方向。

多组学研究是探究生物系统中多种物质之间互作的方法，包括基因组学、表观基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学、微生物组学等，这些物质共同影响生命系统的表型、性状等。

什么是多组学关联分析？

关联分析是一种实用的分析技术，就是发现存在于大量数据集中的关联性或相关性，从而描述一个事物中某些属性同时变化的规律和模式。

需要特别注意的是：相关 ≠ 因果；相关 ≠ 必然

因果关系的论证一般需要严密的分子实验。

图示：分子的相互作用，产生关联

组学技术及其关联性

不同组学

① 表观组（差异表观分子特征）：甲基化、组蛋白修饰、开放染色质区、lncRNA、circleRNA、miRNA... ...

② 转录组（差异基因表达）：mRNA

③ 蛋白组（差异蛋白）：蛋白质

④ 代谢组（差异代谢物）：代谢物

⑤ 微生物组（差异菌群）：菌群结构

多组学关联的意义：串联证据，互相验证，从不同的角度合力探索和解释生物学问题

判断组学之间是否可以进行关联：是否有关联的生物学理论基础。

如：

• 启动子区甲基化会抑制基因的表达。

• 基因主体甲基化与基因表达正相关。

• 开放染色质状态与基因表达有关。

• 蛋白质是mRNA翻译的产物。

• miRNA可与mRNA相互作用影响其表达和翻译

关联分析的主要套路

基于参考文献和数据库：项目异质性强，Case by Case 模式

基于代谢通路等已知数据库：高度依赖已知代谢网络解读深度，无法探索未知

基于统计学：数据最朴质的结构特征解析，可以获取未知信息，甚至可以为拓展新的知识体系提供帮助

图示：实际应用中往往三管齐下

易基因主要表观组学技术分类

DNA甲基化/羟甲基化位点/区域
RNA甲基化位点/区域
转录因子结合区、组蛋白结合区
DNase超敏位点、开放染色质区

图示：易基因组学技术研究内容

多组学关联分析方法

（1）直接关联

一个基因的功能元件甲基化情况影响该基因的表达。

• 重叠分析

• Pearson/Spearman 相关性分析

（2）模型关联

基于基因转录、蛋白质、代谢物等之间的上下游相互作用联系。

• 多元线性模型(multiple linear model)

（3）网络关联

基于分子功能和通路的富集性。

• WGCNA module correlation

• EMDN algorithm

• SNF algorithm

多组学关联分析方法图例

（1）直接关联

① 重叠分析

特点：简单粗暴，也适用于样本量少的情况。

分析结果：韦恩图。

图例：WGBS + total RNA-seq，含DMR的差异表达基因、差异miRNA靶向的差异表达基因、差异siRNA靶向的差异表达基因三者之间的重叠关系分析

关联理论基础：DNA甲基化、miRNA和siRNA协同作用调控基因表达。

② 皮尔森/斯皮尔曼相关性分析

特点：准确计算相关性程度（R值），及其显著性（p值）。

分析结果：散点图（+拟合线）、相关性热图

图例：血液组织RRBS+RNA-seq，DMR的甲基化水平与差异表达的表达水平之间的皮尔森关联分析。

关联理论基础：DNA甲基化可直接调控基因表达。

图例：肠道宏基因组+宏病毒组，健康与炎症性肠病（UC）组分别计算噬菌体与细菌丰度之间的皮尔森相关性并发现差异。

关联理论基础：噬菌体可侵染细菌进而影响肠道菌群的结构。

图例：胚胎scRNA-seq+蛋白质组，两连续发育阶段之间的RNA和表蛋白质表达的相关性分析。

关联理论基础：RNA转录和蛋白质翻译具有上下游关系。

图例：肠道宏基因组+代谢组，不同管理状态下川金丝猴肠道中短链脂肪酸与肠道菌群的皮尔森相关性分析。

关联理论基础：肠道中有多类菌群可直接产生短链脂肪酸这类益生物质。

（2）模型关联

回归分析（regression analysis)是确定两组或两组以上变量间关系的统计方法。回归分析按照变量的数量分为一元回归和多元回归。两个变量使用一元回归，两个以上变量使用多元回归。

多元线性回归模型(multiple linear model)

特点：基于基因表达、蛋白质、代谢物等之间的直接和间接相互作用联系。

分析结果：关联网络图

图例：肠道菌群16S+血液代谢组+肝脏转录组，通过多元线性模型关联分析，筛选出若干优秀模型，组建低剂量抗生素饲喂促进仔猪快速生长的多组学调控网络。

关联理论基础：肠道菌群可通过产生代谢物进入血液，运输至肝脏影响肝脏细胞的基因表达。

（3）网络关联

细胞内所有大分子相互作用的集合，称为相互作用组（Interactome），是大多数基因型与表型关系的基础，可以用来指导解释组学技术检测到的变化如何干扰整个机体。

机体的分子响应和变化具有功能富集性、通路富集性。因此不同组学检测数据也具有相似的功能富集性和变化规律。

网络关联算法正是基于这些生物学理论基础。

基于WGCNA的共变关联网络分析（WGCNA module correlation)
基于表观模块的差异网络分析（EMDN algorithm）
相似性网络融合分析（SNF algorithm）

分析结果：关联网络图

①基于WGCNA的共变关联网络分析

利用组间差异基因鉴定共甲基化和共表达模块。
模块-模块相关性、模块表型相关性可以有效识别具有功能富集性的多组学变化模块。

图例：血液组织RRBS + RNA-seq，基因的差异甲基化模式与基因表达模式的共变关联网络分析。

前期直接关联得到的基因很少；
改变策略，采用基于WGCNA的共变关联网络分析，得到的共甲基化和共表达基因均富集于自噬相关通路。

关联理论基础：基因组DNA的甲基化与基因表达变化具有功能富集性。

图例：肠道宏基因组+代谢组，不同管理状态下川金丝猴粪便代谢物与肠道菌群基于WGCNA的共变关联网络分析。

鉴定了2对强正相关的物种和代谢物的共变化模块。
圈养条件的代表性模块中发现了潜在致病菌和相关代谢物。

关联理论基础：肠道菌群可响应环境变化改变肠道微环境中相关的代谢产物的浓度。

基于表观模块的差异网络分析（EMDN algorithm）

利用组间差异基因鉴定共甲基化（共表达）模块。
差异共甲基化（差异共表达）网络筛选。
从多个差异共变网络中筛选共同网络。

图例：基于表观模块的差异网络分析（EMDN algorithm）

相似性网络融合分析 (SNF algorithm）

图例：

SNF算法(图1d)使用了一种基于信息传递理论的非线性算法，该方法迭代更新每个网络，使其与其他网络更加相似。经过几次迭代之后，SNF收敛到单个网络中。
算法的优点是，弱相似性(低权重的边)消失，有助于降低噪声，而在一个或多个网络中存在的强相似性(高权重的边)被添加到其他网络中。

图例：融合网络三个cluster内部的连接性、紧密性和cluster之间相对较少的边界，说明该算法可以更清晰地显示多形性成胶质细胞瘤(GBM)患者的分型情况。

其他网络关联分析方法

从关联走向因果：组学分子实验验证

基因表达相关的组学：

基因敲除/抑制
基因过表达

甲基化组学：

甲基化酶基因的敲除与过表达

宏基因组（肠道菌群）：

无菌动物模型
粪菌移植

以上是关于多组学分析方法及组学分子实验验证的解析，易基因提供表观组、转录组、微生物组等多组学科研技术服务。

参考文献：

Yan H, Bombarely A, Xu B, et al.Autopolyploidization in switchgrass alters phenotype and flowering time viaepigenetic and tranion regulation[J]. Journal of experimental botany,2019

Zhang, D., Hu, Q., … Gao, F. (2019). Epigenetic and transcriptional signatures of ex situ conserved golden snub-nosed monkeys (Rhinopithecus roxellana). Biological Conservation, 237, 175–184.

Zuo, T., Lu, X. J., Zhang, Y. (2019). Gut mucosal virome alterations in ulcerative colitis. Gut, 68(7), 1169–1179.

Gao, Y., Liu, X.. (2017). Protein Expression Landscape of Mouse Embryos during Pre-implantation Development. Cell Reports, 21(13), 3957–3969.

Evaluating the influence of conservation activities on the gut microecosystem of Rhinopithecus roxellana based on establishment of a gut microbiome gene catalog. Unpublished.

Inter-correlated gut microbiota and SCFAs changes upon antibiotics exposure links with rapid body-mass gain in weaned piglet model. The Journal of nutritional biochemistry,2019, 74: 108246.

Multiple network algorithm for epigenetic modules via the integration of genome-wide DNA methylation and gene expression data. BMC Bioinformatics , 2017,18(1), 1–13.

Similarity network fusion for aggregating data types on a genomic scale. Nature Methods , 2014,11(3), 333–337.

Di Nanni, N., Bersanelli, M.(2020). Network Diffusion Promotes the Integrative Analysis of Multiple Omics. Frontiers in Genetics,11(February), 1–12.

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易基因： oxRRBS+RRBS揭示炎症性肠病导致发育异常的表观遗传机制｜甲基化研究

大家好，这里是专注表观组学十余年，领跑多组学科研服务的易基因。

2020年12月31日，美国明尼苏达大学Natalia Y. Tretyakova教授团队在《Int J Mol Sci》杂志发表题为“Multi-Omics Characterization of Inflammatory Bowel Disease-Induced Hyperplasia/Dysplasia in the Rag2-/-/Il10-/- Mouse Model”的研究文章，该研究通过简化基因组甲基化测序（RRBS）+氧化简化基因组甲基化测序（oxRRBS）及对应的转录组测序（RNA-seq）揭示炎症性肠病 (IBD)导致基因组中甲基化和羟甲基化模式变化，表明了IBD导致发育异常的表观遗传机制。

标题：Multi-Omics Characterization of Inflammatory Bowel Disease-Induced Hyperplasia/Dysplasia in the Rag2-/-/Il10-/- Mouse Model （Rag2-/-/Il10-/-小鼠模型中炎症性肠病诱导增生/发育异常的多组学表征）

时间：2020-12-31

期刊：International Journal Of Molecular Sciences

影响因子：IF 6.208

技术平台：RRBS、oxRRBS、RNA-seq、RT-qPCR等

研究摘要：

假设表观遗传失调在炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）和结肠癌发展之间的关联中发挥作用。本研究对从肝螺杆菌（H.hepaticus）感染的IBD小鼠模型中收获近端结肠组织，并进行DNA甲基化组、DNA羟甲基化组和转录组分析。RRBS和oxRRBS分析共鉴定出1606个差异甲基化区域（DMR）和3011个差异羟甲基化区域（DhMR），与胃肠疾病、炎性疾病和癌症相关的基因和这些DMR/DhMR重叠。RNA-seq揭示了许多与炎症和癌症相关的基因显著表达变化，包括Duox2、Tgm2、Cdhr5和Hk2在内的几个基因在DNA甲基化/羟甲基化和基因表达水平上均表现出变化。总体而言，本研究结果表明，慢性炎症会引发基因组中DNA甲基化和羟甲基化模式的变化，从而改变关键肿瘤发生基因的表达，并可能导致结直肠癌的发生。

项目设计：

（1）样本选取：

IBD与正常小鼠近侧肠道组织的5mC、5hmC、表达图谱分析

（2）项目设计流程图：

实验结果

（1）肝螺杆菌（H. hepaticus）感染的Rag2-/-/Il10-/-小鼠结肠组织的组织病理学分析

图1：炎症性肠病（IBD）与正常组织的组织病理学检验

动物研究设计：Rag2-/-/Il10-/-小鼠在6-7周龄时H.hepaticus感染或无菌培养基处理（对照），并在感染后20周处死
感染H.hepaticus（橙色）的Rag2-/-/Il10-/-雄性小鼠和仅用盐水处理的对照小鼠（蓝色）的结肠组织的组织病理学结果：通过对胃肠道不同部位的炎症、水肿、上皮缺陷、隐窝萎缩、增生和发育异常（Dysplasia）的个体评分求和来计算组织学活性指数（n=7）
感染或未感染H.hepaticus的Rag2-/-/Il10-/-雄性小鼠胃肠道不同部位的整体5-甲基胞嘧啶（5mC）水平，（盲肠每组n=4，横结肠每组n=3，近端和远端结肠每组n=7）
感染或未感染H.hepaticus的Rag2-/-/Il10-/-雄性小鼠胃肠道不同部位的整体5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）水平

（2）炎症性肠病（IBD）诱导的增生/发育异常中DNA甲基化和DNA羟甲基化表征

图2：差异甲基化区域（DMR）和差异羟甲基化区域（DhMR）富集的基因在与癌症发生和胃肠疾病相关的基因富集。

RRBS和oxRRBS技术示意图：通过比较RRBS和oxRRBS数据集分析5mC和5hmC水平。

B-C. 通过RRBS与oxRRBS结合鉴定1606个DMR（B）和3011个DhMR（C）的热图。

D-E. 通过Ingenuity Pathway Analysis（IPA），使用显著性阈值p=0.05的Fisher精确检验，预测受DMR（D）和DhMR（E）基因影响的功能和疾病。

（3）差异甲基化分析揭示IBD诱导的增生/发育异常中存在广泛的DMR和DhMR

图3：Rag2-/-/Il10-/-小鼠在H.hepaticus诱导炎症在单核苷酸分辨率下的甲基化和羟甲基化动态变化

784个低DMR，822个高DMR，1454个低DhMR和1557个高DhMR的基因组分布饼图
DMR/DhMR内每个CpG位点5mC和5hmC的动态变化。0.1是5mC/5hmC水平显著性变化的截止值。数字代表点数量。

表1：H.hepaticus诱导的Rag2−/−/Il10−/−小鼠炎症CpG位点IPA差异甲基化和羟基甲基化的经典通路

（4）IBD诱导增生/发育异常中的基因表达变化

图4：炎症性肠病（IBD）和对照小鼠中近端结肠的转录组分析

基于最高方差的500个基因的无监督分层聚类，显示对照组和IBD组之间明显分离
IPA鉴定上游调控因子Il10ra周围的网络
使用显著性阈值p=0.05的Fisher精确检验，预测受差异表达基因影响的疾病和功能

（5）DNA甲基化异常调控差异表达基因的综合分析

图5：IBD诱导的转录组、DNA甲基化组和羟甲基化组变化之间的相关性

A-B. 差异表达且DMR（A）或DhMR（B）富集的基因散点图。颜色表示不同基因组表征，点大小表示每个区域的CpG数量。

DNA表观遗传标记在IBD诱导的结直肠癌（CRC）发生中的作用的模型。

总结：

本研究采用RRBS+oxRRBS在H.hepaticus感染的IBD Rag2-/-/Il10-/-小鼠模型中，分别绘制了IBD诱导的DNA羟甲基化和DNA甲基化在全基因组中的变化。同时结合RNA-seq基因表达分析，研究结果首次全面揭示了结肠炎症诱导的表观遗传学变化，为进一步研究IBD生物标志物的发现提供了有用的信息，并有可能促进IBD新疗法的未来发展。

关于易基因精准DNA甲基化/羟甲基化测序（oxBS-seq）

羟甲基化5hmC是哺乳动物基因组上的第六碱基，在发育、衰老、神经退行性疾病、复杂疾病及肿瘤发生过程中起重要作用。DNA羟甲基化是近年发现的一种新的DNA修饰并迅速成为研究热点。随着研究的深入，发现之前被认为是检测DNA甲基化标准的重亚硫酸盐测序并不能区分DNA甲基化（5mC）和DNA羟甲基化（5hmC）。

易基因联合剑桥大学建立了化学氧化法结合重亚硫酸盐转化的测序技术（oxidative bisulfite sequencing, oxBS-Seq），该技术不仅可以精确检测DNA甲基化，排除DNA羟甲基化的影响，还可以双文库结合同时单碱基分辨率精确检测DNA羟甲基化。

传统BS转化无法区分5mC和5hmC

传统的Bisulfite测序中，5hmC经过Bisulfite处理后变为CMS，CMS在测序中仍然被读作C碱基，因此不能区分5mC和5hmC。

oxBS技术原理

技术优势：

DNA甲基化检测全新的“标准”；
单碱基检测DNA羟甲基化修饰；
多重质控标准检测氧化效率和Bisulfite转换率；
实验偏好性低，重复性高（R2＞0.98）；
易基因自主研发的甲基化特异性多重PCR引物设计软件；
可满足多种测序应用需求：
全基因组氧化甲基化测序（oxWGBS）
简化基因组氧化甲基化测序（oxRRBS）
目标区域靶基因氧化甲基化测序（Target-oxBS）。

技术路线：

技术指标：

易基因科技提供全面的DNA甲基化研究整体解决方案，技术详情请致电易基因。

参考文献：

Han Q, Kono TJY, Knutson CG, Parry NM, Seiler CL, Fox JG, Tannenbaum SR, Tretyakova NY. Multi-Omics Characterization of Inflammatory Bowel Disease-Induced Hyperplasia/Dysplasia in the Rag2-/-/Il10-/- Mouse Model. Int J Mol Sci. 2020 Dec 31;22(1) pii: ijms22010364.