使用Sentieon加速甲基化(WGBS)分析

Posted 2023-04-17 insvast

全基因组甲基化测序(WGBS)是一种研究DNA甲基化的方法，以全面了解在基因组水平上的表观遗传变化。在进行WGBS数据分析时，通常需要使用专门的比对工具，因为这些工具需要能够处理亚硫酸盐转化后的数据。

以下是四个不同的WGBS比对分析流程：

• Bismark：Bismark是一个基于Bowtie2或HISAT2比对器的流行WGBS分析工具。它允许处理双链亚硫酸盐转化测序数据，并提供甲基化位点的检测和分析。
• BitmapperBS：BitmapperBS是一个专门为亚硫酸盐转化测序数据设计的高效比对器。它可以处理双链测序数据，并提供甲基化位点的检测和分析功能。
• BSseeker2：BSseeker2是一个用于WGBS数据分析的比对工具。它可以处理单链和双链亚硫酸盐转化测序数据，并支持Bowtie, Bowtie2和SOAPaligner作为比对器。BSseeker2提供了甲基化位点检测和甲基化水平计算等功能。
• BWA-Meth：BWA-Meth是一个基于BWA的比对工具，专门用于处理WGBS数据。它提供了处理双链亚硫酸盐转化测序数据的功能，并可以进行甲基化位点检测。
  这四种分析流程各自具有不同的特点和优势，选择哪个流程取决于研究需求、计算资源以及期望的分析速度和准确性。实际应用中，可以尝试比较这些流程的结果，以找到最适合您需求的解决方案。

WGBS甲基化分析流程加速方案

Sentieon BWA + MethyDackel
在甲基化分析中，Sentieon软件可以与其他工具结合使用以提高分析速度和准确性。在这种情况下，Sentieon BWA被用来替换原始的BWA-mem，与MethyDackel结合，建立起Sentieon BWA-Meth流程。

在这个流程中，Sentieon BWA首先负责处理亚硫酸盐转化后的测序数据进行高效的序列比对。由于Sentieon BWA的优化，比对速度和准确性得到了提高，同时减少了计算资源的消耗。

接下来，MethyDackel被用于从Sentieon BWA的比对结果中提取甲基化信息。MethyDackel能够检测甲基化位点，计算甲基化水平，并生成甲基化状态的统计和可视化结果。

通过结合Sentieon BWA和MethyDackel，Sentieon BWA-Meth流程能够为全基因组甲基化分析提供一个高效且准确的解决方案。这使得研究人员可以更快地分析甲基化数据，更有效地挖掘潜在的生物学意义。

具体加速流程

Sentieon处理甲基化数据的过程可以概括如下：

1. Sentieon甲基化分析流程：
   

   • 使用EpiQC研究中的全基因组甲基化测序数据（doi:https://doi.org/10.1101/2020.12.14.421529）。
   • 数据预处理：读取修剪、质量控制。
   • 使用四种不同的分析流程进行比对，包括Bismark、BitmapperBS、BSseeker2和BWAMeth。
   • 使用Sentieon BWA替换原始的BWA-mem，并与MethyDackel结合，建立Sentieon BWAMeth流程。
   • 比对后处理：使用不同的模块进行甲基化位点调用和CpG甲基化水平识别。

2. 甲基化映射速度比较：
   

   • 每次比较中，使用相同的随机种子对一百万对读取进行随机抽样。
   • 在24个CPU线程的服务器上使用各软件的默认参数运行比对。
   • 记录每个重复实验的性能时间。
   • Sentieon BWA-Meth比原始的BWA-Meth速度提高了2.5倍，与BitMaperBS的速度相似。

3. 甲基化映射准确性比较：
   

   • 比较不同甲基组文库制备中的流程映射准确性；使用Samtools stats和Qualimap生成后比对统计数据。
   • 显示库总读取的参考映射结果分布。
   • Sentieon BWA-meth具有最高的主要映射率和最低的未映射率。

4. CpG位点读取覆盖率比较：
   

   • 计算14个库和4个分析流程中识别出的CpG位点的测序覆盖率。
   • 与其他测试工具相比，Sentieon BWA-Meth在CpG位点提供了更高的测序覆盖率。

5. Sentieon甲基化分析流程结论：

   • Sentieon BWA-Meth与BWA-Meth提供相同的结果。
   • Sentieon BWA-Meth流程显示出最高的处理速度，比开源流程快约2倍。
   • Sentieon BWA-Meth具有最高的主要映射率和最高的CpG位点读取覆盖率。

6. 应用说明 - 安装

   • 安装bwa-meth

# Prerequisites: samtools # these 4 lines are only needed if you don\'t have toolshed installed 
wget https://pypi.python.org/packages/source/t/toolshed/toolshed-0.4.0.tar.gz 
tar xzvf toolshed-0.4.0.tar.gz 
cd toolshed-0.4.0 sudo 
python setup.py install

wget https://github.com/brentp/bwa-meth/archive/master.zip 
unzip master.zip 
cd bwa-meth-master
sudo python setup.py install

• 安装MethylDackel

# Prerequisites: htslib and libBigWig
git clone https://github.com/dpryan79/MethylDackel.git 
cd MethylDackel 
make LIBBIGWIG="/some/path/to/libBigWig.a" 
make install prefix=/some/installation/path

• 安装BWA（开源）

# Only used for indexing reference genome. 
git clone https://github.com/lh3/bwa.git 
cd bwa; make

7. 准备测试数据

   • 从bwa-meth下载测试数据并使用开源BWA对参考基因组进行索引。

wget https://github.com/brentp/bwa-meth/raw/master/example/ref.fa 
wget https://github.com/brentp/bwa-meth/raw/master/example/t_R1.fastq.gz 
wget https://github.com/brentp/bwa-meth/raw/master/example/t_R2.fastq.gz

• 使用开源BWA构建index索引

bwameth.py index $REF #Indexes with BWA-MEM (default)

• 确保安装了开源的BWA在$PATH下，而不是Sentieon BWA
  

8. 读取比对：

   • 使用Sentieon BWA进行读取比对。

   • 将Sentieon bin文件夹添加到$PATH。

export PATH=<PATH_TO_SENTIEON>/sentieon-genomics-202112.05/bin:$PATH

*   运行bwa-meth，通过sentieon util sort进行排序。 

bwameth.py --threads 16 \\
        --reference $REFERENCE \\
        $FQ1 $FQ2 | \\
sentieon util sort -i - –sam2bam –o output.bam

• 确保屏幕输出以下内容。否则，bwa-meth将使用开源bwa。

This software is licensed to [[e-mail]] by Sentieon Inc. 
version: sentieon-genomics-202112.06

9. 制表：

   • 使用开源工具MethylDackel。

MethylDackel extract ref.fa output.bam

• 输出结果为bedGraph文件，第4列表示在给定位置有甲基化C的证据的读取/读取对数，第5列表示未甲基化C的等价值。
  

Sentieon软件下载

甲基化数据QC：使用甲基化数据计算样本间的相关性

样本间的相关性，可以反映公司加样时是否存在重复加样的错误。

下面简要介绍一下如果利用甲基化数据计算样本间的相关性

1、提取甲基化探针的snp位点、CpG的beta值

下面用的示例文件是minfi包自带的。

如果是自己的数据，那么提取甲基化snp位点用的是没有经过过滤的原始数据。

首先，安装：

BiocManager::install(c("minfi","minfiData","sva"))
library(minfi)
library(minfiData)
library(sva)
baseDir <- system.file("extdata", package="minfiData")
targets <- read.metharray.sheet(baseDir)
RGSet <- read.metharray.exp(targets = targets)
manifest <- getManifest(RGSet)

这里可以看到不同探针的情况：

一条龙服务，提取甲基化探针的snp位点、CpG的beta值：

MSet <- preprocessRaw(RGSet) 
RSet <- ratioConvert(MSet, what = "both", keepCN = TRUE)
GRset <- mapToGenome(RSet)
beta <- getBeta(GRset) #提取CpG的beta值
snps <- getSnpBeta(RGSet) #提取SNP位点

2、CpG和SNP的beta值位点示例结果

提取完CpG和SNP后，看一下各自的示例结果：

CpG的beta值示例结果：

甲基化SNP位点的示例结果：

3、计算相关性

计算样本间的相关性，我们用R自带的cor函数即可。选用的数值为SNP的甲基化数值

计算相关性代码：cor(snps)

结果如下：

这里解释一下，为什么不选用CpG的beta值计算相关性。

如下图所示，我分别用了前100、1000、10000个CpG的beta值计算样本1（5723646052_R02C02）和样本2（5723646052_R04C01）的相关性，相关性均在0.97以上（蓝色框框），用snps位点计算相关性时，样本1和样本2的相关性则为0.1426071（红色框框）。

可见，CpG的beta值计算出来的相关性都特别高，根本不能区别样本间真实的相关性。

因此，计算样本间相关性，推荐甲基化探针的SNP位点。