10X Genomics单细胞转录组测序

Posted 2023-04-16

参考技术A 这篇文章里只讲10X Genomics的3'转录组测序和5'转录组测序。

首先看一下10X Genomics长什么样子吧？
它的功能就是制备油包水的乳浊液，配合微流控芯片一起工作。

利用微流控技术分选单个细胞，然后将“1个bead”和“单个细胞”包裹在油滴中
一张芯片一次可以处理8个样本，每一列孔对应于一个样本

脑袋不容易想象？来看这张图：
beads在压力的作用下逐个通过管道，而细胞和酶在另一个垂直管道，尽可能将1个细胞打到1个bead上，然后混入油相。通过油滴包裹单个细胞和bead，形成油包水的结构，创造1个bead吸附1个细胞内的mRNA的微环境。

partitioning oil为油相
bead的体积比较大，被包裹的细胞比较小（图中可以看到的细胞还没有被裂解），而油相和bead之间充斥的液体中含有各种酶，其中就包括反转录酶（细胞裂解之后，bead通过polyT引物吸附游离的mRNA，然后直接在油包水的结构中进行反转录获得cDNA）。

beads表面含有很多绒毛状的短序列引物，短序列包括4个部分：R1、10X barcode(一个bead只有一种，任意两个barcode序列之间至少存在2个碱基的差异)、UMI（UMI是一段随机序列，每一个DNA序列都有自己的UMI序列，经过PCR和深度测序得到的reads可以看出，哪些reads起始于一个原始cDNA分子，因此它的使用降低了PCR的偏好性）、polyT（真核生物mRNA 3'末端含有polyA尾巴，polyT用来与mRNA的3'末端互补配对）

以下4个步骤的讲解基于图片 “3'单细胞转录组测序文库构建过程”

通过polyT富集到beads上的mRNA，在酶的作用下反转录生成cDNA，同时在新合成链的5'端增加几个GC残基，在此基础上通过酶引入switch oligo（switch oligo是专门设计的引物用于cDNA扩增）

通过switch oligo做引物扩增

通过以上两个步骤，便成功地将mRNA的序列信息引入到带有barcode和UMI的cDNA里，同时对它扩增。其中的barcode用来区分细胞a和细胞b...，UMI区分转录本1，转录本2...完成了对序列的特殊标记后，便可以序列回收，即使摆脱了油包水的结构，我们也可以通过“barcode序列”和“UMI序列”判断序列来源。

将cDNA序列回收之后，便可以像普通的二代测序的步骤一样进行建库测序（片段化、引入接头等等），同时二代测序的建库过程中会添加index来区分不同的样本。
二代测序的建库步骤可以参考这个连接里
https://www.jianshu.com/p/1ccdaea9e822

上面解释过10X Genomics 3'转录组的测序，这种方式获得的测序序列其实都是3' polyA尾巴附近的mRNA序列。为啥呢？因为barcode和UMI在mRNA的3' polyA那一端（二代测序是短读长的测序方法，建库过程中对插入测序片段的长度有要求），mRNA长度太长时，其 5’端序列被打断，断裂的这部分序列便丧失了barcode和UMI的指引。

5'转录组测序所使用的捕获mRNA的beads与3'转录组测序不同，其polyA引物被换成了switch oligo，其目的就是将mRNA的5'端连接到barcode和UMI。

同样使用polyA来富集mRNA，以polyA为起点来做cDNA的反转录，同时在其5'末端加入C残基，这里的C残基会与beads上switch oligo的G残基互补配对。这样就将mRNA的5'末端连接到带有barcode 和 UMI的引物，同时以C残基为起点进行链的合成，最终获得带有barcode 和 UMI的cDNA链。后面的建库测序步骤便与3'转录组测序相同了。

非链特异性转录组测序

非链特异性转录组测序

转录组（transcriptome）在广义上是指细胞内全部转录产物的集合，狭义上是指细胞中所有转录本（mRNA）的集合。转录组测序通常来说是指依托于高通量测序平台对细胞中的mRNAs进行测序。经过信息的整理和分析，可在不同的样本中挖掘具有意义的差异表达基因，研究可变剪切，融合基因事件和在转录水平上进行性状定位等。转录组测序现已广泛的应用到科研基础研究，临床疾病研究和药物研发等领域。

常规转录组测序根据实验样品的不同可分为真核生物转录组测序和原核生物转录组测序；根据建库时的方法和研究目的不同可分为链特异性转录组建库和非链特异性转录组建库；根据测序物种有无参考基因组可以分为有参基因组转录组测序和无参基因组转录组测序。

 

技术路线

 

 

 

有参考基因组的转录组测序

 

无参考基因组的转录组测序

技术优势

 

 

 

测序策略

 

 

 

 

测序策略	PE100或PE150
建议数据量	真核生物：一般测序5-6G深度测序10G 原核生物：一般测序1G深度测序5-10

 

收样要求

 

 

 

组织	500mg新鲜植物样本，300mg新鲜动物样本注: 肿瘤组织优先选择RNAlater保存
细胞	>5*106悬浮/贴壁细胞
血液	>3ml全血/全血分离的有核细胞
RNA总量	>3 μg，浓度 >50ng/μl, RIN值>6.5
对于较难进行取材的医学类样品，可以适当降低样本标准。

 

 

您可以得到的数据分析

 

 

 

有参非链特异性转录组生物信息学分析流程

 

常规分析	高级分析
高通量序列与参考基因组比对 测序数据质控分析 基因表达量分析 基因的可变剪切分析（真核生物） 基因结构优化及新转录本预测 SNP、InDel等基因结构变异筛查 样本间基因差异表达分析 差异表达基因的KEGG和GO功能分析	差异基因的蛋白互作分析 个性化定制分析

 

 

 

 

无参（de novo）非链特异性转录组生物信息学分析流程

 

 

常规分析	高级分析
测序数据质控分析 参考序列拼接 Unigene的长度统计及功能注释 Unigene的表达谱构建 SSR分析 ORF预测 SNPs分析 序列信息统计 Unigene在样本之间各类差异基因表达 Unigene的KEGG和GO功能分析	差异基因的蛋白互作分析 个性化定制分析

 

案例解析

 

 

 

利用肿瘤血小板RNA-seq发现直接利用血液在分子通路层面上诊断

泛癌症、分辨不同癌症类型和鉴定癌症基因突变的方法

(有参转录组测序)

肿瘤相关的血小板（Tumor-educated platelets, TEPs）在全身或病灶范围上会根据肿瘤的生长情况而改变自身mRNA的表达。本研究对228个原发肿瘤或肿瘤转移患者和55个健康个体血液中的血小板细胞进行了转录组测序，欲验证肿瘤血小板中mRNA的变化是否能指导癌症的诊断和分类。测序后，通过序列比对，共鉴定出5,003个已知的血小板mRNA生物标记，例如B2M, PPBP, TMSB4X, PF4等，同时也鉴定出了一些非编码RNA（lncRNAs）。

癌症患者与健康个体相比，1,453种mRNA表达量提高，793种mRNA表达量下降。聚类分析结果显示癌症患者与健康个体的血小板细胞mRNA信息有较大差异。随后，课题组基于差异表达基因，利用不同算法对6种不同的癌症类型进行诊断和区分，结果显示可达到较好的癌症分辨效果。

本研究通过对血小板细胞进行转录组测序，发现了基于肿瘤相关血小板细胞中mRNA的信息对肿瘤进行早期诊断和癌种区分的方法。

 

Best, Myron G., et al. "RNA-Seq of tumor-educated platelets enables blood-based pan-cancer, multiclass, and molecular pathway cancer diagnostics."Cancer cell(2015): 666-676.（Imapct factor：27.407）

 

 

A. 测序后分析5,003个mRNA的上下调表达情况（红色代表上调基因，蓝色代表下调基因）

B.健康个体和肿瘤患者mRNA表达量差异热图（上方横条中红色代表健康个体，灰色代表肿瘤患者）

 

蝾螈不同组织de Novo转录组测序鉴定与肢臂重生相关mRNA与其编码的蛋白质

(无参转录组测序)

哺乳动物的肢体再生能力非常有限，蝾螈却可以重生自身肢臂。对蝾螈再生肢臂的机制的理解并不透彻，其中一个重要的原因是蝾螈基因组巨大且不完整。本研究对蝾螈16种不同组织（包括肢臂胚芽组织、睾丸、肌肉、卵巢等）的共42个样品进行转录组测序，并de novo拼接测序数据，绘制出了一个近乎于蝾螈全转录组的图谱 （完整率高达88%）。同时，通过对比分析肢臂再生组织和其他组织的mRNA测序数据和表达情况，并结合先前文献，鉴定出了在肢臂再生中特异性表达的转录本和其编码的蛋白；CIRBP和KAZALD1蛋白。本研究除完成高完整度的蝾螈全转录组图谱构建及注释外，还揭示了在蝾螈进行肢体重生中的重要基因，极大地填补了蝾螈肢体再生研究的空白，并为再生医学研究奠定了基础。

 

Bryant, Donald M., et al. "A tissue-mapped axolotl de novo transcriptome enables identification of limb regeneration factors."Cell reports(2017): 762-776.（Impact factor: 8.282）

 

A. 针对蝾螈16种不同组织样本的转录组测序和de novo拼接流程

B. 159个在肢臂胚芽组织中富集的mRNA和在各种组织中的表达热图，标黄的基因代表预测为可能与肢臂再生相关的基因

研究趋势与研究热点

 

 

 

寻找研究对象的重要性状、表型或生物标志物；

构建研究对象在不同的处理条件下，或者不同表型研究对象的基因表达谱。寻找表达差异大的关键基因；

研究对象时序性或空间特异性变化的主控因素；

无参考基因组物种的基因表达谱构建；

研究近缘物种之间的进化差异等。

常见问题

 

 

 

在进行转录组测序之后，可以通过哪些方法对目标转录本进行验证？
在进行转录组测序后，生物信息学分析会展现出不同样品中差异较大或有特殊意义的转录本，为了对这些有意义的转录本进行验证和继续研究，qRT-PCR方法可通过对目标转录本的表达进行定量或定性验证。除此之外，还有Northern Blot，FISH（荧光原位杂交）和免疫荧光实验等方法也可用于测序结果验证。

转录组一般要测多大的数据量才合适？
转录组测序所需要的测序量要根据多个因素考量确定，这些因素包括了待测物种转录组大小，待测物种转录组中基因的数量和各类基因的丰度。不同的物种在以上因素的变化可能不同，因此为了保证数据分析结果的可靠性和准确性，我们建议客户一定要在测序之前对待测物种的转录组的大小进行评估。对于有参考基因组的物种，可以根究先前的经验，分析基因组信息、编码基因个数、碱基数及丰度进行预测评估。大部分物种的测序量以6-8G为佳。而多倍体植物，例如八倍体小麦这类基因组较大且复杂的物种来说，我们推荐适当增加测序量至10-12G。

转录组测序的数据质量影响因素主要有哪些？

转录组测序的质量可能会受到以下因素的影响：（1）RNA严重的降解可能会影响建库与测序的质量 （2）过低的RNA起始量可能会影响建库与测序质量，可以通过适当地增加PCR循环数来解决 （3）转录组中基因丰度的较大差异可能会影响基因检测的分辨率，高丰度的基因可能会掩盖低丰度表达的基因。