Duplex UMI-ctDNA测序技术

Posted 2023-04-16

参考技术A

同一癌种的不同患者，同一个肿瘤患者的不同治疗阶段、同一肿瘤组织的不同区域，肿瘤的生物学特征均存在一定的差异。 液体活检 既可以克服 组织检测 的 异质性 ，又具有 简便、安全、无创、实时 等特点，尤其是对于无法进行手术或穿刺，又或者肿瘤位置导致取样困难的患者而言，液体活检是一项可以弥补组织检测局限性的方法，近年来在 肿瘤靶向治疗 、 耐药监测的实时评估 等方面发挥着重要的作用。

目前液体活检的靶标包括： 游离的循环肿瘤细胞 （CTCs）、 循环肿瘤DNA （ctDNA）、 循环RNA （ctRNA）和 外泌体 （携带有细胞来源相关的多种蛋白质，脂类，DNA，RNA等）。
ctDNA 是肿瘤细胞在 坏死 、 凋亡后 释放的一种游离DNA（ cfDNA ），在血液中的半衰期短，可以实时反映肿瘤的动态变化。

目前用于ctDNA液体活检的技术主要有 ARMS-PCR 、 数字PCR（ddPCR） 和 第二代测序（NGS） 。
NGS能同时检测多个基因的多种不同变异形式，是应用最广泛的的基因检测技术。但由于NGS的实验流程技术较为复杂，在 文库构建 、 目标区域捕获 及 测序过程中 不可避免的会引入一些扩增和测序的错误，这些错误我们把它们叫做 背景噪音 ，而ctDNA检测 往往突变频率较低 ，受到背景噪音 干扰较大 ，来自ctDNA样本中的低频突变往往淹没在背景噪音之中，造成 假阴性 或 假阳性 结果，这就限制了ctDNA检测的 灵敏度 和 特异性 。

分子条形码技术（UMI）
分子条形码又称 分子标签 （Unique Molecular indentifier，UMI），它的 原理 就是给 每一条原始DNA片段 加上一段 特有的 标签序列，经文库构建及PCR扩增后一起进行测序。这样，根据 不同的标签序列 我们就可以区分 不同来源的DNA模板 ，分辨哪些是PCR扩增及测序过程中的随机错误造成的假阳性突变，哪些是患者真正的携带的突变，从而提高检测灵敏度和特异性。
①　2012年5月，Tim Forshew等人率先开发了基于分子标签的TAm-Seq方法。
②　2012年9月，Michael W. Schmitt等利用双链分子标签技术将错误率显著降低。它的技术原理如下：

深度好文 单细胞RNA测序技术简介

参考技术A 文献解读

Potter, S. S. (2018).Single-cell RNA sequencing for the study of development, physiology anddisease. Nature Reviews Nephrology , 14 (8), 479.

        人体细胞中包含大约2万个基因，每个细胞存在自身特异的基因表达模式，仅对部分基因进行表达，导致了细胞特异性的蛋白质成分和生物功能。近来单细胞测序技术的兴起，使得我们能够在单个细胞水平上研究基因的表达模式，从而能够对细胞间的异质性问题进行更精准的研究。

        这篇综述出自美国俄亥俄州辛辛那提儿童医疗中心发育生物学系的Steven Potter研究员，文章主要围绕单细胞测序技术展开，包括现行单细胞测序技术的基本流程、存在问题与难点、数据处理过程，及其在生物医学领域的一些应用等。

        单细胞测序技术主要包括以下流程：组织解离得到单细胞悬液，细胞裂解，RNA逆转录成cDNA，PCR扩增，高通量测序，数据分析等。

        具体到操作层面上，单细胞解离主要包括三种方法：（i）人工显微操作，需要借助于显微镜和微量吸管等设备，同时人工成本较高；（ii）激光捕获显微切割（Laser capture microdissection，LCM）技术，使用激光束从冷冻组织中切割分离单个细胞；（iii）荧光激活细胞分选（fluorescence-activated cell sorting，FACS），通过荧光标记将细胞群分开。FACS的方法通量较高，是目前的主流方法。细胞解离过程主要存在两个难点：（i）如何避免外在刺激对细胞转录产生影响。细胞内部存在早期反应基因（Early response genes）能够对外界刺激做出快速反应，因此解离过程中可能会发生细胞转录的变化。这个问题可以通过加入转录抑制因子，采用嗜冷性蛋白酶在冷冻条件下解离，或是仅对核RNA进行测序分析等方法进行克服；（ii）组织中可能存在一些细胞极难解离，或是十分脆弱容易破碎等，这个问题目前仍没有很好的解决方法。

        解离之后的单细胞处理，包括建库和扩增，主要采用的是基于微流控（Microfluidics）技术的方法。在微流控芯片中进行细胞裂解、反转录和cDNA的扩增，之后进行测序。代表性方法是Fluidigm C1测序平台，这样的方法精度较高，成本也较高。另一种是基于微液珠（Microdroplet）的方法，将分离的单细胞与微液珠结合形成油包结构，在油包结构中进行反转录和扩增，之后进行测序。代表性方法如10X Genomics测序平台。这种方法测序通量较高，当前的测序成本大约为1美元/细胞。

        单细胞测序的数据分析主要包括以下三步：（i）计算基因表达矩阵。根据测序reads上的barcode和UMI标签将reads比对到特定细胞的特定基因上并计数，以获得每个细胞中不同基因的表达量；（ii）质控。去除基因表达量很少和线粒体DNA含量较高的细胞；（iii）数据降维和聚类。通过主成分分析（Principal components analysis）及其他一些方法对基因表达数据进行降维，然后通过迭代性聚类分析对细胞进行分型。

        单细胞测序数据中的偏差主要来自于三个方面：（i）基因表达伴有随机性。许多基因的转录并不是一个稳定的过程，而是伴有很强的随机性，其mRNA的含量也是在不断变化的；（ii）单细胞mRNA含量较低。尤其对于一些转录水平更低的基因来说，mRNA检测十分困难；（iii）反转录和扩增过程的效率较低。

        单细胞测序技术的应用主要体现在三个方面：（i）细胞分化研究。借助单细胞测序以阐明同一亲本细胞如何分化产生不同类型的子代细胞；（ii）癌症发生发展研究。对肿瘤组织进行单细胞测序以对肿瘤微环境进行更加精准的刻画；（iii）其他疾病研究。对正常组织和疾病组织进行单细胞测序，以研究致病通路、鉴定新的疾病标志物以及可能的治疗靶标等。