转录组数据标准化--Normalization

Posted 2023-03-09

参考技术A 转录组数据经过比对到参考基因组获得对应基因count值后，因为测序深度以及基因长度的关系，在进行差异分析之前，还需要进行标准化。标准化是转录组数据差异分析必不可少的一步。

用于转录组差异分析的目前主要是两个软件：Deseq2 和 edgeR；针对这两款软件，学习一下目前的应用的标准化方法。

通过针对每个样本获得对应的大小因子Cj来使不同样本的计数具有可比性，即使这些样本的排序深度不同。

首先先确定几个后续会使用的变量

具体计算函数如下：

cpm(..., normalized.lib.sizes = TRUE)       edgeR

原理：将库的大小作为标准化的一种形式是有直观意义的，因为将一个样本测序到一半的深度，平均会得到映射到每个基因的读取数的一半。

计算方法：

calcNormFactors(..…,method="upperquartile",p=0.75)      edgeR

原理：与规范微阵列数据的标准技术类似，本方法是根据分位数等参数匹配基因计数的样本间分布。例如，可以简单地按样本的中位数对其计数进行缩放。由于零和低计数基因的优势，中位数对不同水平的测序工作没有提供信息。相反，建议使用每个样本的上四分位数(75-第百分位数)。

计算方法： 1. 计算样本上分位数（75%）然后按库大小缩放读取计数

2. 重新计算总的reads count的上分位数

3. 计算Cj因子

calcNormFactors(..…, method ="RLE")           edgeR

estimateSizeFactors(...)          DESeq, DESeq2

calcNormFactors(..,method="TMM")       edgeR