RAffymetrix芯片分析(1)-affy

Posted 2023-04-19

参考技术A Affymetrix芯片储存着大量的生物信息学数据，因此有必要从实战出发的角度，汇总下Affymetrix芯片处理的流程。下面以GSE1438为例

常用的质量控制的指标： 平均数法、RLE、NUSE和RNA降解曲线 根据以上指标综合决定实验是否合格，并提出质量不合格的样品。

可以看出，这个芯片的整体检查率并不太高，且GSE23740、GSM23745、GSM23746、GSM23750、GSM2375和GSM23757的RLE和NUSE偏离中心太多，整体RNA降解斜率偏低。在实际科研中，我们最好寻找高质量的芯片。

考虑到整体芯片质量不佳，过滤后剩余的样本数会比较少，下面就假装质量还可以进行下游分析（请大家谅解！）

当然affy包主要针对的是旧版的Affymetrix芯片，如hgu95/95和hgu133系列。下一篇我们来看看oligo包。

参考链接：

R语言_Affymetrix芯片数据处理

用affy包读取affymetix的基因表达芯片数据-CEL格式数据

生物芯片介绍

参考技术A 基因芯片技术的特点是使用寡聚核苷酸探针检测基因。使用ReadAffy函数读取CEL文件获得的数据是探针水平的（probe level），即杂交信号，而芯片数据预处理的目的是将杂交信号转成表达数据（即表达水平数据，expression level data）。存储探针水平数据的是AffyBatch类对象，而表达水平数据为ExpressionSet类对象。基因芯片探针水平数据处理的R软件包有affy, affyPLM, affycomp, gcrma等.
Affy芯片数据的预处理一般有三个步骤：

可以看到：ReadAffy()读入的CEL芯片数据以AffyBatch类数据形式存储，而背景消减后得到的依然是AffyBatch类数据。
MAS方法应用后PM和MM的信号强度都被重新计算。RMA方法仅使用PM探针数据，背景调整后MM的信号值不变。

此方法获得的结果比线性方法要好，做非线性拟合时不是取整张芯片而仅取部分（一列）作为基线。

可以看到，同一芯片不同探针的信号值的缩放倍数是不一样的。

这种方法认为（或假设）每张芯片探针信号的经验分布函数应完全一样，使用任两张芯片的数据做QQ图应该得到一条斜率为1截距为0的直线。

如循环局部加权回归法（Cyclic loess）和 Contrasts方法。

常用的汇总方法是medianpolish, liwong和mas。liwong方法仅使用PM做背景校正（pmcorrect.method="pmonly"）。例如：

最后的结果 ExpressionSet 类型数据

也是由affy包提供，其背景处理方法为rma法，归一化处理使用分位数法，而汇总方法使用medianpolish：