如何从肿瘤免疫应答的角度设计研究思路？

Posted 2023-04-17

参考技术A 在抗肿瘤免疫应答过程中，药物的疗效很大程度上取决于肿瘤特异的效应性免疫细胞的功能状态，而效应细胞的增殖和活性受免疫检查点共刺激和共抑制信号的共同调节。因此增加抗肿瘤免疫反应往往是通过 增强作为正向调节的共刺激信号，或阻断负向调节的抑制信号 。但往往事情没有我们想的那么简单，尤其是在异质性很强的肿瘤微环境中，各种免疫调控网络纷繁复杂，这也就促使我们采用多种免疫检查点抑制剂联合治疗的方案。

目前发现具有可用于药物治疗的免疫检查点分子有很多： PD-1, PD-L1, CTLA4, LAG-3, TIM-3, TIGIT, PVRIG, NKG2A 等，因为PD-1/PD-L1和CTLA4最早被发现，也研究的最多，因此目前抗CTLA-4 与抗 PD-1/PD-L1 联合策略也被用于多种肿瘤的免疫治疗中。但这种组合方式在很多肿瘤患者中的疗效并不显著，还具有很强的副作用，因此近些年科学家正不断研究别的免疫检查点联合用药方式。其中因 TIM-3 广泛表达于T细胞、Tregs、B细胞、NK细胞、DCs、巨噬细胞和肥大细胞等各种免疫细胞，并与 Galectin9 、高迁移率组盒1( HMGB1 )和癌胚抗原相关细胞粘附分子1( CEACAM-1 )结合成为了近几年基础和临床研究工作者的青睐。此外，TIM-3与PD-1在耗尽的T细胞和TILs上的共表达现象为联合使用抗PD-1和抗TIM-3提供了一个思路。并且一些小鼠模型的实验为这种组合的有效性提供了直接证据，几个I期的抗PD-1联合抗TIM-3的研究已经在晚期和转移性实体肿瘤中开始施行。

那么接下来我就先通过解读今年发表在 Nat Commun (IF:14.91)一篇名为：Galectin-9 interacts with PD-1 and TIM-3 to regulate T cell death and is a target for cancer immunotherapy的文章介绍免疫检查点分子情侣PD-1/TIM-3以及 Galectin-9 的三角恋故事。

1.质谱分析筛选PD-1的结合蛋白

研究者首先通过IP/Western和免疫复合物的质谱分析确定了Galectin-9是PD-1的结合蛋白，且具有免疫调节活性。这里可能大家需要想到作者肯定筛选出了很多可以与PD-1结合的蛋白，然后通过实验逐一进行功能验证，最后发现Galectin-9蛋白具有较好的表型，因此后续都对这个蛋白进行分析。 类比这样的方法我们还可以筛选与自己研究基因相结合的蛋白，从而缩小靶基因的范围。 后续实验证明了Galectin-9与PD-1的结合是高度选择性的，并且是由多糖介导的，它不影响PD-1与其同源配体PD-L1的结合，也不影响PD-1和治疗性抗体Pembrolizumab和nivolumab的结合。

Galectin-9主要有两个CRD ( N-CRD，C-CRD )结合位点，研究者发现Galectin-9主要通过其 C-CRD 与PD-1结合，而N-CRD和C-CRD均介导其与Tim-3的结合。为了确定PD-1上与Galectin-9结合的糖基化位点，将PD1上4个可能的糖基化位点(N49、N58、N74和N116)上的天冬酰胺(N)残基分别突变为谷氨酰胺(Q)，发现 N116Q 突变在很大程度上影响了PD-1与Gal-9的结合，因此Galectin-9/PD-1的相互作用主要由Gal-9的C-CRD和PD-1的N116连接的糖链介导。

图1：

2. Galectin-9可与PD-1和TIM-3交联形成复合物

紧接着研究者通过平板蛋白结合实验，发现在没有Galectin-9的情况下，PD-1 ECD并不结合TIM-3 ECD，而Galectin-9促进了它们的协同结合。DuoLink实验和IP/Western实验的结果进一步证实了这一点。但神奇的是， 在没有外源Galectin-9的情况下，PD-1/TIM-3相互作用也能被检测到 ，这种相互作用并不被乳糖或PD-1 N116Q突变所抑制。这就好比PD-1/TIM-3本来是一对情侣，只是感情并不是太稳定，这时生活中出现了一个和两人都能处得来的好友Galectin-9，表面是调节二者关系，其实是和其中一人搞暧昧。

图2：

3. Galectin-9可作为癌症免疫治疗的靶点

通过流式细胞术分析,研究者发现 Galectin-9诱导的T细胞死亡可能与抗癌免疫抑制有关 ，因此研究者评估了抑制Galectin-9在癌症治疗中的潜力，并推测这可能是由于抑制Galectin-9后T细胞共刺激受损所致。接下来，通过将抗Galectin-9与 GITR (TNFRSF共刺激受体家族的一个成员)的激动型抗体DTA-1相结合验证了这一想法，它们的组合在不同的肿瘤模型中协同抑制了肿瘤的生长和延长了总生存期。因此，这些结果表明Galectin-9是肿瘤免疫治疗的靶点，并且抗Galectin-9联合GITR激动剂可以诱导出强大的抗肿瘤活性。

图3：

4. 质谱流式证实抗Galectin-9治疗针对特定的肿瘤浸润性T细胞亚群

只有推测，没有动物实验当然是不行的，研究者接下来就在荷瘤小鼠中进行体内实验。通过分析几组质谱流式的结果，研究者发现抑制Galectin-9可以选择性地扩大了瘤内TIM-3+ CD8T和CD4T细胞亚群，这也包括具有免疫抑制性的Treg细胞， 并且Treg细胞在总CD45+TIL中的比例增加 ，特别是CD8T细胞中CD8T_1亚群的比例在抗Galectin-9处理后增加了两倍以上。由于Treg可以特异性的抑制抗肿瘤免疫，因此接着通过联合使用抗Galectin-9和抗GITR（可特异下调Treg）后，CD8T亚群的比例进一步增加，而Treg细胞几乎完全丧失。因此，抗Galectin-9单一疗法虽然扩增了具有效应潜能的CD8T细胞亚群。然而，它的治疗效果可能会因为Treg细胞的共同扩增而受到影响。

图4：

一般情况下，CD8T细胞在肿瘤抗原的不断刺激下会逐渐失去功能，变成衰竭前体细胞。在这个阶段的CD8T细胞会高表达TCF1，同时也表达PD-1,TIM-3，如果肿瘤抗原持续存在，CD8T细胞就会走向终末衰竭的T细胞，并且逐渐走向死亡。但是处在这个终末衰竭性T细胞状态前的T细胞可以被抗Galectin-9治疗给逆转成具有较强增殖和分化能力的功能性T细胞，只不过同时扩增的还有Treg细胞。因此，联合使用抗GITR来控制Treg细胞的扩增则解决了这一难题。

图5：

5.单细胞数据揭示Galectin-9的表达分布

其实讲到这，文章的主体研究思路都讲完了，但是为了进一步解析Galectin-9在各类免疫细胞的表达情况，作者还分析了之前发表的一套单细胞数据。所以，这也进一步说明了数据挖掘的重要性。无论是多高级的研究思路，都是需要大数据作为支撑才变得更有说服力，这个数据可以来源于自己花钱测的，也可以来自已经发表的研究。这里作者就通过数据挖掘发现Galectin-9(LGALS9)在多种免疫细胞中都有表达，而且发现与对PD-1治疗没有应答的患者相比，应答患者表达更高水平的Galectin-9,这也证实了抗Galectin-9和抗PD-1联合用药的可能性。

图6：

6.关于免疫应答研究可做的生信思路

好了，上面介绍了如何通过 实验研究 免疫检查点分子间的互作关系从而探索影响肿瘤免疫治疗应答的因素，学习了一些实验设计的研究策略。然而，为了符合我一贯写作的气质，下面得对应来点别的有深意的生信干货。其实作为数据挖掘的热点，有关肿瘤对免疫治疗应答的相关生信思路有很多，下面主要列举几篇今年刚发表的研究免疫治疗应答的文章思路:

图7：

第一篇解读的是发表在Mol Ther Oncolytics（IF:7.20）杂志上篇名为“Single-cell RNA-sequencing analyses identify heterogeneity of CD8 + T cell subpopulations and novel therapy targets in melanoma”的文章。作者重新分析了已经发表的黑色素瘤单细胞数据，揭示出来7群CD8 T细胞亚群，这些亚群具有不一样的特征。此外，作者还鉴定出了3个在衰竭性CD8 T细胞上过表达的基因(PMEL, TYRP1和EDNRB)，它们与患者的不良预后显著相关。像这种思路，只要有数据都能很容易的复现一篇，至于发到什么样的杂志上，就看证实的发现是否新颖。

图8：

另一篇发表在 J Immunother Cancer （IF:13.75）篇名为：CXCL13 shapes immunoactive tumor microenvironment and enhances the efficacy of PD-1 checkpoint blockade in high-grade serous ovarian cancer的文章则是从影响免疫浸润的趋化因子着手。这个思路主要是对明星分子在不同癌型中的功能进行探索，需要通过实验来进行功能验证。因为明星分子被研究的很多了，除非做泛癌分析，否则基本上很难做出太新颖的东西。但是这类实验设计很简单，只需要证明某个明星分子在 特定的癌型 中通过何种方式影响免疫治疗反应即可。

图9：

如果觉得明星分子没有太多研究新意，当然还可以通过各种生信方法筛选出关键基因。接下来一篇发表在 Oncoimmunology （IF:8.11）的篇名为“YKT6, as a potential predictor of prognosis and immunotherapy response for oral squamous cell carcinoma, is related to cell invasion, metastasis, and CD8+ T cell infiltration”的文章就是先通过 WGCNA 的方法筛选出和免疫抑制相关的基因YKT6，进行后续的分析。对于这种新筛出的之前没有报道过的基因就比较容易说故事，当然这个思路有一些运气的成分，很有可能百费周折筛选出的基因要么没有很好的功能，要么就已经被报道。

图10：

如果你肿瘤免疫的生物学背景知识不强，也没有很好的实验平台，那么还有最后一种选择，那就是万能膏药之临床预测模型。最后一篇发表在 Front Immunol （IF:7.56）杂志上，篇名为“9-Gene Signature Correlated With CD8 + T Cell Infiltration Activated by IFN-γ: A Biomarker of Immune Checkpoint Therapy Response in Melanoma”的文章就是通过构建和免疫治疗相关的临床预测模型。有关临床预测模型的构建，现在已经很成熟了，如 LASSO,COX,NMF 等模型都可以套用。这个思路前提是需要找一个较为新颖切入点，且最后能被多套数据集验证出来，那就基本可以发表一点不错的SCI文章了。

7.小结

本文从研究肿瘤免疫治疗应答的这个科学问题着手，先是通过一篇以实验为主的研究型文章解读了如何通过巧妙的实验设计筛选出有潜力的免疫检查点分子，随后分别解读了一些纯生信和生信联合实验的文章思路。有关肿瘤免疫治疗问题可以研究的方向有很多，但是 一般需要先了解研究癌型的免疫治疗进展 ，有的问题在一些癌型中已经被研究的很通透，那就没有必要再去浪费时间了，而同样的科学问题在一些肿瘤中就还是一个未知，那这样的问题就比较有研究的价值了。此外，就像开头说的因为免疫治疗应答与否牵扯的问题主要和免疫细胞的比例有关，而免疫细胞在肿瘤中的占比不高，因此bulk测出来的高表达基因主要是肿瘤细胞自身的基因，从这个角度看基于 bulk数据差异分析找出的高表达基因需要用肿瘤细胞系去做实验验证 。而单细胞数据就比较利于揭示免疫细胞上表达和免疫治疗的基因，但是商品化的10X平台可测得的基因不多，我的经验是先从单细胞数据揭示各种免疫细胞的比例，找出应答和非应答的差异免疫细胞亚群，从而进一步找出高表达的基因，最后通过简单实验进行免疫细胞的功能验证就基本都可以发表一篇不错的生信文章了。

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肿瘤细胞新抗原

肿瘤免疫治疗如火如荼，但如何在患者受损的免疫系统中重新唤起患者自身的T细胞活性则是个体化免疫治疗的核心关键问题。在最新一期《新英格兰医学杂志》上，挪威学者Vessela Kristensen通过点评一项最新发表在《Science》上的研究，为肿瘤免疫治疗提供了研究方向。

虽然具有高突变负荷的肿瘤已经与较差的预后相关联，但在这个肿瘤免疫治疗时期，突变则可以提供肿瘤特异性细胞毒性的治疗靶标并且这将会对治疗有益。数百种肿瘤类型的下一代测序已经揭示了在肿瘤细胞DNA中的体细胞突变比以前已知的更多。这些突变许多发生在基因的编码区，因此转录成RNA，然后将其翻译成蛋白质。这些蛋白质的片段最终可能表现为由HLA分子在肿瘤细胞表面上展示的多肽，其中它们可以被T细胞识别为“外源”肽- 所谓的新抗原 。

免疫治疗如免疫检查点抑制剂（其设计用于增强患者自身的免疫系统）的效力已证明与突变负荷相关。已经在患者中鉴定了的靶向新抗原的T细胞库能伴随着新抗原的时间变化谱进行共表达。在用过继性T细胞治疗成功治疗的患者中，对于新抗原有反应的T细胞伴随着同源抗原的丧失而消失。而新发生的突变与新的T细胞反应性相互对应。这些发现为新的个体化和真正的肿瘤特异性免疫疗法奠定了基础。

在各肿瘤中发现的突变的基础上，患者特异性的新抗原可以通过计算预测的。然而，似乎只有非常少量的候选新抗原能在患者中引起免疫应答。事实上，例如在可以提供T细胞靶标的黑色素瘤的数百个突变中，只有少数（在2到5之间）已经被发现能成功产生新抗原特异性T细胞，并可以在肿瘤浸润淋巴细胞中鉴定。对于外周血中的新抗原反应性T细胞，也观察到类似的情况；它们几乎仅代表了携带程序性细胞死亡-1（PD-1）受体的T细胞，其在激活时抑制T细胞的细胞毒性功能。这些T细胞表达的T细胞受体（TCR）已经显示能识别自体肿瘤，但被发现进对非常小部分（约1％）的预测的候选新抗原有反应。通过计算的新抗原的预测能力是否不足？肿瘤抑制反应性T细胞还是诱导其死亡？最重要的是，我们能否通过改善对新抗原的T细胞反应——也就是说，增强它们的反应并使得它们对更多的新抗原更敏感？实现这一目标可以补充现有的检查点抑制剂药物的临床研究，例如阻断PD-1受体的nivolumab。

Str?nen等人最近描述了解决这些问题的一个意想不到的方法，其测试来自健康供体的T细胞是否能够识别肿瘤新抗原并且被他们激活。在没有癌症的人体内的免疫系统是否会以与患有癌症的人的免疫系统相同的方式响应新抗原。在通过对来自三个黑色素瘤患者的肿瘤的DNA和RNA的测序鉴定出的几百个基因突变中，作者选择了57个对突变肽段有高度亲和力的，并且这些都是预测能结合到HLA-A * 02：01位点的。作者然后合成对应新抗原的RNA片段，并将这些片段导入来自HLA-A * 02：01阳性健康供体的单核细胞衍生的树突细胞（免疫系统中“专业”抗原呈递细胞）。他们在体外测试了这些转染的抗原呈递细胞，诱导来自获得树突细胞的相同健康供体的原始细胞毒性T细胞增殖能力。这三个患者总计仅具有2个新表位的T细胞应答，而健康供体的T细胞被11个新表位激活。响应于新表位的T细胞克隆是对低浓度的突变有反应，而不是对野生型的同源抗原。TCR序列被鉴定并遗传转移到第二健康供体的T细胞。通过它们从HLA-A * 02：01阳性患者中有杀死黑素瘤细胞的能力显示了这种通过TCR-修饰的T细胞治疗潜力，其中突变最初来自所述HLA-A * 02：01阳性患者（图1）。这些实验显示来自健康供体的血液的T细胞，有潜力成为用于测试新抗原（包括由患者自身免疫细胞所忽略的新抗原）免疫原性的平台。当然，来自健康供体的T细胞不是对所有候选新抗原都有响应。Str?nen等人的结果提示，相对于单独使用计算结合亲和力预测而言，候选新抗原的“命中”率（即，成功预测能诱导免疫应答的候选新抗原）能通过估计肽和主要组织相容性复合物分子之间的结合稳定性来得到改善。

 

Str?nen等人的研究提醒人们可以从非直观的和可利用的实验系统获得不一样的思路，在这个例子中，选用了来自与患者至少一个HLA等位基因匹配的健康人的外周血。来自多个供体的T细胞的所有组成部分可用于研究免疫原性新抗原的性质。供体T细胞被在患者的受损免疫系统下突变的表位激活。这一发现通过借助于将新抗原特异性供体来源的TCR遗传引入患者的T细胞中，从而为开辟新一代个性化免疫治疗提供了可能。

参考文献：Vessela  N. Kristensen. The Antigenicity of the Tumor Cell — Context Matters. N Engl J Med  376;5 February 2, 2017

作者：精准医学网
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來源：简书
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