Edit Distance编辑距离（NM tag）- sam/bam格式解读进阶

Posted 2020-08-15 Digital-LI

sam格式很精炼，几乎包含了比对的所有信息，我们平常用到的信息很少，但特殊情况下，我们会用到一些较为生僻的信息，关于这些信息sam官方文档的介绍比较精简，直接看估计很难看懂。

今天要介绍的是如何通过bam文件统计比对的indel和mismatch信息

首先要介绍一个非常重要的概念--编辑距离

定义：从字符串a变到字符串b，所需要的最少的操作步骤（插入，删除，更改）为两个字符串之间的编辑距离。

（2016年11月17日：增加，有点误导，如果一个插入有两个字符，那编辑距离变了几呢？1还是2？我又验证了一遍：确实是2）

这也是sam文档中对NM这个tag的定义。

 

编辑距离是对两个字符串相似度的度量（参见文章：Edit Distance）

举个栗子：两个字符串“eeba”和“abca”的编辑距离是多少？

根据定义，通过三个步骤：1.将e变为a 2.删除e 3.添加c，我们可以将“eeba”变为“abca”

所以，“eeba”和“abca”之间的编辑距离为3

 

回到序列比对的问题上

下面是常见的二代比对到ref的结果（bwa）：

D00360:96:H2YLYBCXX:1:2110:18364:84053    353    seq1_len154_cov5    1    1    92S59M8I17M1D6M1D67M    seq30532_len2134_cov76    1    0    AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACCCTGTCTCTAATAAAATACAAACAATTAGCCGGGCATGGTGGCACGCGCCTTTAGTCCCAGCTACTAGGGAGGCTGAGGCAGGGGAATTGTTTGAACCCGGGAGGTGGAGGTTGCAGTGAGCGGAGTTTTTTTCACTGCACTCCAGCCTGGTGACAAATCAAAAATCCATTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACAAAACAACAAA

DDDDDHIIIIIIII<EHHII?EHH0001111111<11<DEH1D1<FH1D<<<C<@GEHD</<11<101<1D<<C<E0D11<<1<D?1F1CC1DE110C0D1011100////0DD<1=@1=FGHCDHH<FG<D0<<<EF?CE<00<<0<D//0;<:D/////;///////;8F.;/.8.8......88.9........-8BBGADHIIHD?>D?HH<,>=HHDD,5CHDCDHD><,,,--8----8-8--    NM:i:25    MD:Z:16A21C16C0A3T15^A6^G1G0T0G3C2T0G1C41A4A2A3    AS:i:49    XS:i:42    SA:Z:seq13646_len513_cov63,125,-,103S125M21S,1,11;    RG:Z:chr22

这是ref序列

>seq1_len154_cov5
GGGAGGCTGAGGCAGGAGAATTGTTTGAACCCGGGAGGCGGAGGTTGCAGTGAGCCAAGATTGCACTCCAGCCTGGATGACAAGAGTGAAACTCTGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

cigar字段包含了序列比对的简化信息，M（匹配比对，包含match和mismatch），=（纯match），X（纯mismatch），I（插入），D（删除），还有N、P和S、H。（注：目前只在blasr比对结果中见过=和X）

根据cigar字段可以统计indel信息，但是无法统计mismatch。

这个时候就可以用到NM tag了，mismatch = NM – I - D = 25 – 8 – 1 – 1 = 15

有兴趣的可以对着cigar数一遍，下面是我无聊数着的结果，也是15个

 

使用python的pysam模块可以很容易的提取出每个比对结果的NM信息

参见之前的帖子：pysam - 多种数据格式读写与处理模块(python)

 

再次验证一遍：证明NM=len(mismatch) + len(insertion) + len(deletion), 而不是 count(mismatch) + count(insertion) + count(deletion) (count的意思是三个碱基的insertion算一个)

>>> bam_file = pysam.AlignmentFile(infile, "rb")
>>> for line in bam_file:
...     if 300 < line.query_alignment_length < 500:
...             break
... 
>>> line.query_alignment_length
321
>>> line.seq
\'CTCTTCATCACGTCACTTGTCCATGTCAATGGCTACAGGTTGGAAGTTTGGCCGCGGAGGGTGGGCAGGCAAGAGAAAGAAATCAGATAGGGCAGATGGTAGGGTAAAAGGAGGGGGTTAAGTGCAAATTGTCTACTGTTTGCAAATGGGAAGCATGTGATTGTTAAAATTTATACGATAAACCTTCTCATCATGTTGAGTCTCATGCTTGCGCCAAGAAGATCGGGTTCGGCGGGTCAAGCTGATAAGCAACTTGGGCAGCAAAGTCGTTCAGTGATACAAAATCATGTGCAAAAATCACAAGCATTCTTATAAACACCA\'
>>> line.cigarstring
\'5148H3M1I2M1I4M2I3M3I3M1D2M1I4M3I1M1I4M1D10M1D5M4I4M3D1M3I18M1I1M1I1M1I4M4D2M1I2M2I4M2I4M1I4M5I4M1I9M1I14M3I1M1I2M2I7M2I7M3I2M1I5M2I1M1I2M1I1M1I4M5I3M1I2M3I1M1I4M4I3M4I2M2I1M3I19M3I10M2I4M1I11M1D27M2I6M25212H\'
>>> line.reference_name
\'Backbone_1\'
>>> line.reference_start
7164
>>> line.reference_end
7413
>>> line.get_tag(\'NM\')
100

取出了一条长度适中的比对结果，cigar字段比较全面。

取出了比对上的ref：

>>> ref = \'CTCTCTCACCACTCCTATTCAACACAGTGTTGGAAGTTCTGGACAGGGCAATCAGGCAAGAGAAAGAAATAAAGGGTATTCAATTAGGAAAAGAGGAAGTCAAATTGTCCCCGTTTGCAGATGACATGATTGTATATTTAGAAAACCCCACTGTTTCAGCCCCAAATCTCCTTAAGCTGATAAGCAACTTCAGCAAAGTCTCAGGATACAAAATCAATGTGCAAAAATCACAAGCATTCTTATACACCA\'

先通过我自己写的cigar校正函数校正：

def formatSeqByCigar(seq, cigar):
    \'\'\'
    Input: query_alignment_sequence and cigar from sam file
    Output: formatSeq
    Purpose: make sure the pos is one to one correspondence(seq to ref)
    \'\'\'
    formatSeq = \'\'
    pointer = 0; qstart = 0; qend = -1; origin_seq_len = 0
    if cigar[0][0] == 4 or cigar[0][0] == 5:
        qstart = cigar[0][1]
    if cigar[-1][0] == 4 or cigar[-1][0] == 5:
        qend = - cigar[-1][1] - 1  # fushu count
    for pair in cigar:
        operation = pair[0]
        cigar_len = pair[1]
        if operation == 0: # 0==M
            formatSeq += seq[pointer:(pointer+cigar_len)]
            pointer += cigar_len
            origin_seq_len += cigar_len
        elif operation == 1: # 1==I
            pointer += cigar_len
            origin_seq_len += cigar_len
        elif operation == 2: # 2==D
            formatSeq += \'D\'*cigar_len
        elif operation == 4 or operation == 5: # 5==H
            origin_seq_len += cigar_len
            continue
        else:
            print (cigar)
            raise TypeError("There are cigar besides S/M/D/I/H\\n")
    return formatSeq, qstart, qend, origin_seq_len

然后分别计算deletion和mismatch：

>>> i = 0
>>> count = 0
>>> while i < len(ref):
    if formatSeq[i] != ref[i]:
        count += 1
    i += 1

>>> count
17
>>> formatSeq.count(\'D\')
11

可以看出deletion有11个，退出mismatch有6个。

随手一推insertion有83个。

而

>>> cigarstring = \'5148H3M1I2M1I4M2I3M3I3M1D2M1I4M3I1M1I4M1D10M1D5M4I4M3D1M3I18M1I1M1I1M1I4M4D2M1I2M2I4M2I4M1I4M5I4M1I9M1I14M3I1M1I2M2I7M2I7M3I2M1I5M2I1M1I2M1I1M1I4M5I3M1I2M3I1M1I4M4I3M4I2M2I1M3I19M3I10M2I4M1I11M1D27M2I6M25212H\'
>>> cigarstring.count(\'I\')
41
>>> cigarstring.count(\'D\')
6

用count计算显然不对。

验证成功

 

真切的明白了计算机有多么伟大，如果要是你肉眼去比对去数的话，我估计你会立马崩溃。