Improving Identification of In-organello Protein-Protein Interactions Using an Affinity-enrichable,
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文献名:Improving Identification of In-organello Protein-Protein Interactions Using an Affinity-enrichable, Isotopically Coded, and Mass Spectrometry cleavable Chemical Crosslinker (利用亲和纯化同位素质谱可断裂化学交联剂,提升细胞器的蛋白-蛋白相互作用的鉴定)
期刊名:Molecular & Cellular Proteomics
发表时间:2020年4月
原文链接(DOI):https://doi.org/10.1074/mcp.RA119.001839
影响因子:4.828
单位: 维多利亚大学,英属哥伦比亚大学
物种:酵母
样品类型:线粒体
技术:质谱交联技术
一、 概述
本研究使用可富集的,同位素标记的,质谱可碎裂的化学交联世界,采用靶向MS2质谱采集策略,改进检测和采集信息处理方法以提升交联肽段鉴定。将这个方法应用与酵母线粒体蛋白互作分析,覆盖了四分之一的线粒体蛋白质组,该方法适用于不同条件下的蛋白结构,蛋白质相互作用,系统性蛋白质功能与异常分析以关联疾病研究。
二、 研究背景
蛋白质及其复杂的相互作用网络在各种生物学过程中起着非常重要的作用,近期发展起来的化学交联质谱检测技术(CLMS)可以从蛋白质组学维度对蛋白质互作进系统性分析。 化学交联试剂通过对特异氨基酸反应形成共价链接,以稳定蛋白之间的相互作用,交联的蛋白经过酶解后,质谱鉴定到的交联肽段可作为蛋白互作的直接证据。
三、实验设计
研究材料
- 酵母培养后分离线粒体
实验策略
- 将分离出的酵母线粒体置于等渗溶液中,加入交联试剂CBDPS分别含有轻重两种同位素制备两个样本;
- 对同一样本进行先后进行低速离心(18,000g)和高速离心(100,000g)来将各种膜结构分开,形成三类样本——低速离心膜结构样本、高速离心膜结构样本和可溶蛋白样本——进行FASP酶解等肽段样本制备工作;
- 将各类样本分别进行SCX分馏,并在之后对每个分馏样本进行亲和富集得到交联肽;
- 将制备样本上机,并基于TOP N/TOP S、MTag、inclusion list采集策略产生质谱结果。
分析策略
- 自研算法,综合了Kojak和Hardklör软件对PSM的打分,针对MS1 的特征峰,将谱图导入Percolator采用机器学习的方式,每个PSM将根据41个参数进行评估。
四、研究成果:
1、建立了一整套完整、包含实验和软件分析的质谱交联检测流程。研究者通过使用一种自研新型多功能交联试剂CBDPS,使得复杂样本中交联肽段更容易在质谱中被检测识别。CBDPS的使用明显提升了交联肽段的富集效果、MS2质谱采集效果,并且还会根据交联肽段谱图特征对数据进行验证。其中CBDPS由于含有生物素标签,结合SCX色谱柱粗提以及avidin柱再富集,使得质谱MS1特征相对未富集样本提升超过一倍(图2)。
图2 亲和富集策略改善交联肽段检测效果
2、研究者对多种质谱采集方法进行了比较。根据同位素标记产生的质量差,产生靶向检测交联肽段效果的MTag和Incl(inclusion list),在样本未进行亲和富集的情况下,相对非靶向的TOPS方法显示出一定优势,但当进行了亲和富集之后,三种采集策略的交联肽鉴定效果相对富集前有明显提升,但彼此之间并无较大不同(图3),作者认为这可能是测试样本比较简单,不能显示出靶向采集策略的优势,在复杂样本中或有更好表现。研究者也开发了一种算法,综合了Kojak和Hardklör软件对PSM的打分,针对MS1 的特征峰,将谱图导入Percolator采用机器学习的方式,每个PSM将根据41个参数进行评估。结果在蛋白间交联肽鉴定数得到了20-30%的提升。
图3 靶向采集技术提高交联肽覆盖度
3、离心预分离结合分馏技术(Fractionation)提高交联肽鉴定水平。如图4,研究者将交联后线粒体样本先后进行低速离心(18,000g)和高速离心(100,000g)将各种膜结构分开,形成三类样本——低速离心膜结构样本、高速离心膜结构样本和可溶蛋白样本。每种样本制成肽段后进行分馏,得到的每个组分都会进行上机以检测各类型交联在各个组分、样本的富集情况。结果表明,蛋白间交联更倾向在高速离心中富集,蛋白内交联更多在低速及可溶蛋白样本中富集,显示出离心预分离对交联肽段鉴定效果改善有所增益。
图4 各类型交联肽鉴定结果总览
4、研究者通过高纯度酵母线粒体和优化的研究策略,构建了迄今为止在单次CLMS实验中最全面的酵母线粒体蛋白相互作用集合。如图5所示,研究发现751种非冗余的交联肽段,涉及了代表338种独特蛋白相互作用的264种酵母线粒体蛋白质。这些数据提供了对酵母线粒体蛋白质组中20%蛋白质的蛋白相互作用的结构见解,其中有71%还没有在EMBL-EBI IntAct分子相互作用数据库中描述过,更有185种从未被发现的蛋白相互作用。该数据涉及了互作蛋白的亚细胞定位(图5A),也为许多线粒体蛋白与可溶的,外周的和完整的膜蛋白之间的相互作用提供了新颖的见解(图5B)。研究者最后通过将鉴定出的交联肽映射到蛋白质数据库(PDB)数据库中可用的线粒体电子传输链中涉及的复合物的现有结构模型,来验证结果的有效性。
图5 蛋白相互作用网络分析和鉴定到的交联肽的亚细胞定位
五、文章亮点:
- 开发了一种带有同位素标记的、可用于亲和富集的、质谱可碎裂的新型交联试剂;
- 通过同位素产生质量差来对交联肽进行靶向的质谱采集策略;
- 结合多种软件和新算法开发了数据分析流程以改善交联鉴定结果;
- 展示了上百种线粒体蛋白相互作用,补充现有交联数据。
阅读人: 王欣然
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