RNA-seq中基因表达表达定量单位选择

Posted 2023-05-05

参考技术A     做RNA-seq可以比较不同样本之间基因表达水平的差异，那么如何衡量基因的表达水平呢？

    最简单的方法是，直接比较mapping到某一个基因的reads数目。但是这种做法有不足：

基因长度差异引起误差：如果一个gene1的外显子长度是gene2的10倍，在某组织内两个基因同样产生一个转录本，建库测序后mapping到gene1的reads数远高于gene2，造成了误差。

测序深度引起误差：相同材料分两份同时建库，假设材料1公司返回数据包含100w条reads，材料2公司返回数据包含200w条reads，mapping到同样一个基因的reads数，材料2大概是材料1的两倍。

为此，通用的做法是用外显子长度和reads总数目来校正，以下是几个衡量表达量的单位：

1.RPKM（主要针对单端测序）

RPKM= total exon reads/ (mapped reads (Millions) * exon length(KB))

mapping到gene1外显子的reads/（mapping到基因组的reads数目*gene1外显子长度）

2.FPKM（主要针对双端测序）

fragments的概念：pair-end reads两个reads都比对上，这一对reads算一个fragment；只有其中一个reads比对上，比对上的reads算一个fragment，所以2*fragments数>reads数

FPKM= total exon fragments/ (mapped reads (Millions) * exon length(KB))

mapping到gene1外显子的fragments/（mapping到基因组的reads数目*gene1外显子长度）

3.TPM

TPMi = ( Ni/Li )*1000000 / Σ Nj/Lj

Ni是mapping到genei的reads数，Li是genei的外显子长度。TPM的定量思路是，每一个检测到表达的gene都用外显子长度进行校正，然后看某一个gene所占的比例。我们其实可以发现，其实TPM就是FPKM值的百分比，参考（ http://www.bio-info-trainee.com/2017.html ）

    做RNA-seq，我们会得到一个纵轴是gene，横轴是样品的表达矩阵，如果用RPKM/FPKM定量，材料i所有基因的表达量之和与材料j的不一定相同（表达矩阵的两列），不适合材料之间的比较，可用于同一材料比较不同基因的表达水平；用TPM定量，任意材料所有基因的表达量之和都是1，可用于比较不同材料间的基因表达。

单细胞RNA-seq比对定量用什么工具好？使用哪个版本的基因组？数据来说话

这么多工具和基因组版本，选择困难症犯了，到底用哪个好呢？

2018 nature - Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons : ENSEMBL release 84 Mus musculus genome

2017 Molecular Cell - Single-Cell Alternative Splicing Analysis with Expedition Reveals Splicing Dynamics during Neuron Differentiation : STAR, human genome (hg19), using GENCODE (v19) gene annotations; sailfish - GENCODE v19 protein-coding and long non-coding RNA annotation. Outrigger

2017 - Science - Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors : UCSC hg19 transcriptome; RSEM; TPM; 可行但是不完美，建议用count

2017 - Cell - Single-Cell Analysis of Human Pancreas Reveals Transcriptional Signatures of Aging and Somatic Mutation Patterns : cutadapt; hg19; 

2015 - Cell Stem Cell - Single-Cell Transcriptome Analysis Reveals Dynamic Changes in lncRNA Expression during Reprogramming : TopHat; mm9; Cufflinks; DESeq

2017 - Nature - : UCSC mm10 mouse transcriptome using Bowtie; RSEM

 

小结：

QC: cutadaptb不错哦

如果只想进行定量，那就用bowtie、bowtie2比对，再用RSEM定量，这CNS用得最多；但是，单细胞能用TPM吗？显然不行，因为表达基因的数量差异太大了，这会带来很严重的偏差。

如果想要Reads count，那还是用FeatureCounts吧。（网上貌似说FeatureCounts比HTseq算法更好一些，但是HTseq2015年发表以来，引用了3000多次了，真是纠结选哪个！！！）

参考：Compariosn Htseq And Feature Count

http://bioinformatics.cvr.ac.uk/blog/featurecounts-or-htseq-count/

http://genomespot.blogspot.hk/2014/09/read-counting-with-featurecounts.html

 

如果想鉴定可变剪切，那就必须Tophat、Hisat2和STAR中选了，Hisat2引用少得可怜；为什么大家都不用呢？STAR的引用秒杀它，Tophat就太老了，不用也罢。