实验技术整理

Posted 2021-03-04 zypiner

常用的分子生物学实验技术：

离心技术：

　　是分离纯化蛋白质、酶、核酸（DNA、RNA）、细胞的最常用方法之一。

 

电泳（electrophoresis）：带电粒子在电场中向着与其所带电荷相反方向电极移动的现象。

　　可用于分离不同分子量的生物大分子。

　　　　1.蛋白质的电泳：

　　　　　　用途：蛋白质的定量。

　　　　2.核酸的电泳：

　　　　　　用途：用于核酸的分离、鉴定、纯化、回收。

　　　　　　　　比如：我只需要长度300bp左右的分子。那么，电泳后，在切胶过程中，只切300bp处的分子即可。

 

蛋白质研究相关的技术：

　　1. 含量测定：

　　2. 结构的测定：

　　　　（1）一级结构的测定：搞清楚蛋白质肽链的氨基酸排列顺序。

　　　　　　方法：Edman降解法、质谱法（MS, 将蛋白水解，多肽链分成小段。检测肽段）

　　　　（2）空间结构测定：蛋白空间结构分析比一级结构分析复杂得多。

　　　　　　方法：X射线衍射晶体分析法、核磁共振法等。

　　3. 功能的测定：

　　　　（1）酵母双杂交（YTH）：

　　　　　　假设：欲检测蛋白X与蛋白Y是否相互作用。

　　　　　　检测方法：

　　　　　　　　将蛋白X与报告基因转录因子的BD融合；

　　　　　　　　将蛋白Y与AD融合；

　　　　　　　　确认蛋白X与蛋白Y形成的复合体能否激活报告基因的表达。如果能激活报告基因的表达，说明：X与Y形成了复合体，则BD和AD靠近，激活了下游报告基因的表达；反之，报告基因不表达。

　　　　　　原理：

　　　　　　　　真核生物的转录因子（尤其是酵母转录因子GAL4），包括两个彼此分离、但功能必需的结构域：一个是与DNA结合的结构域-BD；一个是转录激活域-AD。BD识别转录因子效应基因的上游序列并与之结合；AD通过与转录复合体的其他成分作用，启动下游的基因转录。

　　　　　　　　即使BD与AD分开，但如果在空间上较为接近时也能激活转录。——利用转录因子的BD、AD这一特性，通过检测转录因子是否启动了其效应基因的表达，可研究蛋白质X与Y是否相互作用。

 

　　　　（2） 蛋白质芯片技术：一种高通量、微型化、自动化的蛋白质分析技术。一次试验中可同时检测几百甚至几千种目标蛋白或多肽。

　　　　（3）免疫印迹技术 Western blotting：利用抗原抗体特异反应的原理。

　　　　　　　　用途：检测样品中特定蛋白质是否存在以及半定量分析、研究蛋白质间的相互作用。

　　　　（4）免疫共沉定技术（co-immunoprecipitation，Co-IP）

　　　　（5）GST pull-down技术

　　　　（6）生物信息学预测蛋白质

　

核酸分子杂交（nucleic acid hybridization）：指来源不同但具有一定同源性的核酸分子变性后，在一定条件下复性时单链之间相互配对，形成杂化双链的过程。

　　在实际操作中，常使用标记过的已知序列的特定核苷酸片段（即核酸探针）与待测样品进行杂交，以确定特定核酸序列是否存在。

　　核酸探针（probe），根据其性质和来源，基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针和人工合成的寡核苷酸探针。

　　　　（1）基因组DNA探针：制备简单、不易降解、标记方法成熟，是最常用的探针。

　　　　（2）cDNA探针：以mRNA为模板，在反转录酶的催化下合成的DNA分子。

　　　　　　　　cDNA探针均为编码序列，不存在内含子和高度重复序列，在探查某些基因的差异表达方面应用较多。

　　　　（3）RNA探针：是一段标记过的RNA分子，用于探测与之互补的DNA或mRNA链。

　　　　　　　　RNA探针在杂交效率、观察基因的正反向转录状况、反义核酸研究等方面有着明显优势。

　　　　（4）人工合成的寡核苷酸探针：如果只知道蛋白质的氨基酸排列顺序，而不知其编码基因的碱基顺序，可以利用人工合成的寡核苷酸探针来探查未知基因的序列。

 

　　核酸分子杂交的类型：

　　　　（1）Southern印迹杂交：将电泳分离的待测DNA片段转移并结合到一定的固相支持物上，并与标记过的DNA探针进行杂交检测的一种方法。

　　　　（2）Northern印记杂交：检测样品的RNA的一种印迹方法。

　　　　（3）原位杂交（ISH）：不改变核酸所在的位置，直接与探针进行杂交的方法。可分为组织原位杂交和菌落原位杂交。

　　　　　　　　组织原位杂交：a）荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization， FISH）——可对基因在染色体上的分布进行精确定位；可对特定RNA在组织或细胞中的空间分布及表达水平进行测定。分辨率高达100-200Kkb。b）基因组原位杂交（genomein situ hybridization，GISH）：主要用于比较基因组学。利用物种之间基因组DNA同源性的差异，以一个物种的基因组DNA作为探针，与另一个物种的染色体进行原位杂交，分析杂交信号在染色体上的分布及强弱程度，比较鉴别不同物种的基因组之间的亲缘关系，探讨基因组的进化机制和速率。

　　　　（4）斑点杂交和狭缝印记杂交：将DNA或RNA变性后直接点样于固相支持膜上，经紫外交联或烘烤固定后，与核酸探针分子进行杂交的一种检测方法，整个过程不需要电泳。

　　　　　　　　相比前几种的优点：操作简单迅速、一张膜上可检测多个样品。缺点：无法检测所测核酸样品分子量大小。

　　　　　　　　用途：检测拷贝数、基因转录水平的变化。

 

基因芯片（gene chip）：

　　包括DNA芯片或DNA微阵列、cDNA芯片，以斑点杂交为基础建立的高通量检测基因表达的一种方法，它将大量已知序列的寡核苷酸或cDNA探针固于固相表面作为探针，然后与标记的待测核酸进行杂交，通过对杂交信号的检测分析，获得待测核酸的各种序列及表达信息。

　　特点：高通量、大规模、高灵敏度、高自动化。

　　用途：基因表达谱分析、基因组比较研究及发现新基因、DNA序列分析、基因诊断、药物筛选、新药发现、合理用药、中草药鉴定等方面。

　   可检测细胞的RNA表达量、细胞的基因组的拷贝数变化、基因组的snp。

 

聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种由引物（primer）介导，利用DNA聚合酶在体外扩增目的基因的方法，也叫基因扩增技术。

　　1. 反应体系：模板DNA、耐热DNA聚合酶、两种引物、四种dNTP、含有Mg2+的缓冲液。

　　2. 反应过程：一般由25~35轮循环构成，每轮循环包括三个反应步骤。

　　　　（1）变性。将反应体系加热到94~95摄氏度，持续30秒左右，使待扩增DNA完全解链成双链，作为聚合反应的模板。若DNA片段长或GC含量高，需设置更长时间及更高的温度，以保证模板完全解链。

　　　　（2）退火。使温度迅速下降到适宜温度并维持30秒，使引物与模板DNA两条链的3`端互补配对。由于引物片段短，结构简单，而且数量远远超过模板DNA的数量，所以DNA模板单链之间结合的机会极少。

　　　　（3）延伸。将反应体系温度升高到72摄氏度，此时DNA聚合酶将以单链DNA为模板，将单核苷酸逐个添加到引物的3`端，使新链不断延长，直至合成结束。

　　3. PCR产物的检测：PCR完成后，需要进行严格的检测分析，以确定是否得到了预期产物。常用的检测方法如下：

　　　　凝胶电泳、酶谱分析法、序列测定分析、核酸分子杂交。

　　4.PCR产物的纯化：

　　　　方法：可用酚-氯仿抽提加乙醇沉淀法，也可以电泳后直接将目的条带切下，再利用商品化的胶回收试剂盒进行纯化。

 

　　PCR引物：

　　　　（1）长度：一般为15~30nt。

　　　　（2）引物的3`末端：这是延伸开始的地方，绝对不能发生错配，不能进行修饰。

　　　　（3）引物的5`末端：引物的5`末端可以进行一定程度的修饰，如加酶切位点、标记生物素、荧光、地高辛，引物突变位点或突变序列、引入启动子序列等。

　　　　（4）还有其它一些特点，比如：碱基组成、引物自身结构引物浓度等。

 

　　PCR技术的应用：获得目的基因、定点突变、基因表达、基因诊断、基因组测序。

　　　　

　　衍生的PCR技术：

　　　　（1）反转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）：将RNA的反转录与PCR过程结合的一种PCR技术。即在反转录酶的作用下，以mRNA为模板反转录生成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。

　　　　　　　　RT-PCR的引物有3种。a）随机引物：对未知的、长的或具有发卡结构的RNA进行反转录，特异性最低。b）Oligo（dT15-18）：适用于有polyA尾巴的mRNA；c）特异性引物：与目的序列互补，是反义寡核苷酸，适用于目的序列已知的情况。

　　　　　　　　注意：确保RNA中无RNase及基因组DNA的污染。

　　　　　　　　用途：分析基因的转录水平、构建RNA高效转录系统等。

　　　　（2）定量RT-PCR（quantitative RT-PCR，QRT-PCR）：

　　　　　　　　在反应体系中设立一定的RNA竞争性参考标准（RNA competitive reference standard，RNA-CRS），与目标mRNA一起进行扩增，就能对目的基因的表达水平做出半定量或定量分析，这就是RT-PCR。

　　　　（3）实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，FQ-PCR）：在PCR反应体系中加入荧光标记分子，利用荧光信号的累积实时监测整个PCR过程，最后通过标准曲线对原始模板进行定量的方法。

 　　　　　　　　原理：形成双链时发出荧光。

　　　　　　　　重要概念：

　　　　　　　　　　Ct值：PCR过程中扩增产物的荧光信号打到设定的荧光阀值时所需的循环次数即为循环阀值Ct。

　　　　　　　　　　溶解曲线：双链变成单链时需要的温度。

　　　　　　　　　　扩增曲线：

 

基因失活技术：利用技术，在DNA或mRNA水平封闭或降低致病基因的表达。

　　常用的基因失活技术有：反义核酸、RNA干扰（RNA interference，RNAi）、核酶、三链DNA。

　　　　RNAi：双链RNA诱发的转录后基因沉默。

 

质粒