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mRNA-seq是目前最常用的高通量测序技术，一般的用法就是看看基因表达谱，寻找差异表达的基因。我和高通量测序数据分析结缘，也是因为RNA-seq。
一开始我对mRNA-seq数据分析一无所知，跑了"tophat+cufflinks"的流程也不知道每一步的原因，把“RNA-seq data analysis：A pratice approach” 看了好几遍，也是云里雾里，当然这些时间并没有白白浪费，终于有一天我恍然大悟，感觉自己终于懂了mRNA-seq数据分析，于是在暑假通过一次实战对自己的所学做了一个总结。
- 转录组入门（1）：软件准备
- 转录组入门（2）：读文章拿到测序数据
- 转录组入门（3）：质量控制
- 转录组入门（4）：了解参考基因组及基因注释
- 转录组入门（5）： 序列比对
- 转录组入门（6)： reads计数
- 转录组入门（7）：差异表达分析
- 转录组入门（8): 富集分析
但是到目前为止，我实际遇到mRNA-seq数据分析分析项目就一个，不过问我问题的人还是有的，于是打算一边整理实验的流程，再稍微整理下自己的对这方面的理解。
先来看一道RNA-seq数据分析的题目吧，能解决这道题目意味着你真的理解了RNA-seq数据分析。这道问题很简单，不需要强大的计算能力，只需要一张纸和一支笔而已。
这道题目出自 The biostar handbook
假设有一个物种非常的小，仅仅只有三个基因： A, B, C，并且这三个基因都转录本长度分别为10bp, 100bp, 1000bp. 你想通过两个不同的条件下研究该物种，分别是野生型(WT)和热激后(HWEAT)。
由于神秘力量，你知道在WT条件下，基因A的表达量是基因B的表达量的两倍，你还知道在WT和HEAT两个条件中只有一个基因发生了变化（其他基因不变），并且该变化能用目前研究手段中检测到。
你为了找那个在WT和HEAT里不同的基因，非常激动的去做了一次没有重复的RNA-seq实验。由于你很激动，所以不小心把样本混在了一起，而且混了比HEAT处理多一倍WT的DNA量。不过好消息是样本还是能够分开的，毕竟加了barcode。最终结果就是你测了2倍的WT DNA和一倍的HEAT。
问题：你需要准确的用read覆盖情况来表征根据上述给的条件。数字不重要，你可以随便写，重点是这些数字能够表征基因的表达情况。请用实际的数字来替代下面的问号部分
| ID | WT | HEAT |
|---|---|---|
| A | ? | ? |
| B | ? | ? |
| C | ? | ? |
思考题：当你觉得你选择的数字能够回答上面的问题，那么再来想想下面的题目，如果你能回答所有问题，那么那就理解RNA-seq是如何工作的啦。
- 由于你在仪器里放了两倍WT材料，你是如何区分出你的样本？
- 每个条件下，每个基因的CPM是多少？
- 每个条件下，每个基因的RPKM是多少？
- 每个条件下，每个基因的TPM是多少？
- 你怎么知道基因在WT样本中，基因A的表达量真的是基因B表达量的两倍？
- 你能知道WT和HEAT处理中表达量发生变化的基因嘛？
- 当前面的3X2的位置的“？”都有了正确的值，这个问题也是可解决的嘛？
然后，你可以再想想：
- 你需要测多少的read，才能让CPM有一个不错的数值？
- 你需要测多少的read，才能让RPKM有一个不错的数值？
- 你需要测多少的read，才能让TPM有一个不错的数值？
- 你觉得引入上述这些具有任意比例因子的措施是否有意义，还是只为了让数字看起来“很好”？