µOR(µ-opioid receptor)–Gi复合物的结构_nature2018_Antoine Koehl, Hongli Hu, Shoji Maeda等

Posted 2021-01-11 kuailemoyu

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#原文标题、作者、期刊

Structure of the μ-opioid receptor–G_i protein complex

Nature volume 558, pages 547–552 (2018)

#总结

#本文前置：Structural insights into μ-opioid receptor activation.　　Nature volume 524, pages 315–321 (20 August 2015)

#tab = 2 blank

本文包含

　　摘要 - 1

　　结论 - 5

　　方法 - 9

　　图 - 5

　　延伸数据　　图 - 8 ，表 - 2

μOR(μ-opioid receptor)–Gi复合物的结构

摘要

G_i: adenylyl cyclase-inhibiting heterotrimeric G protein　　腺苷酸环化酶抑制型异源三聚体G蛋白

DAMGO : [D-Ala², N-MePhe⁴, Gly-ol]-enkephalin　　H-Tyr-D-Ala-Gly-N-MePhe-Gly-OH　　N→C　　最后一位甘氨酸羰基被羟基取代

　　1、本文得到了冷冻电镜下，3.5?水平的 μOR-DAMGO 和 μOR-Gi(无核酸) 的结构。

　　2、DAMGO 占据了吗啡喃配体口袋，N端与受体的保守残基互作，C端参与阿片类配体选择的重要区域。

　　3、将 μOR-Gi 复合物与之前已经确定结构的 GPCRs-Gs 比较，得到了两个不同之处：

　　　　（1）TM6螺旋的位点（后文中指氨基酸的替换导致的结构变化）；

　　　　（2）G蛋白α亚基与受体核心的互作。

3.5 ? cryo-EM map of a μOR–Gi complex

apyrase : 三磷酸腺苷双磷酸酶，EC 3.6.1.5 ，NTP -> NDP + Pi -> NMP + 2Pi

scFv : single-chain antibody fragment 或 single-chain variable fragment

GTPγS : GTPgammaS (GTPγS, guanosine 5‘-O-[gamma-thio]triphosphate)

　　1、DAMGO是 μOR 选择的兴奋剂脑啡肽的合成类似物，将 DAMGO-μOR 与 G_i1 异源三聚体共孵育，得到的复合物用 apyrase 去除 GDP。

　　2、Gi 连有 scFv16，scFv16-Gi 与 DAMGO-μOR 通过 scFv16 稳定，scFv16 还可抑制 GTPγS 介导的无核酸复合物的分离。

　　3、用单粒子冷冻电镜初步获得 μOR–DAMGO–G_i–scFv16 的三维图，标称分辨率 3.6?。

　　4、scFv16 结合了一个包含 αN helix of Gα_i and the β-propeller of Gβ 的复合平面，与 μOR–Gα_i界面距离超过 20?，并且没有干扰 Gα 和 Gβ 亚基的界面。(Extended Data Fig. 1)

　　5、scFv16 的信号差异将图像分辨率提升到了 3.5?。

　　6、3.5? 的条件下，μOR-DAMGO，μOR-G_i 。(Fig. 1a, b)

Activation of μOR by a peptide agonist

BU72 : small molecule morphinan agonist，通过复杂的环系统结合

Nb39 : active-state stabilizing nanobody　　In the presence of 5 μM nanobody 39 (Nb39), the affinity of the potent morphinan agonist BU72 increases from 470 pM to 16 pM. BU72 has a dissociation half-life of 140 min in the presence of Nb39. Nb39 also enhances the affinity of μOR agonists DAMGO and endomorphin-2, indicating that the effect is not limited to morphinan agonists.

　　1、之前工作已得到 2.2? 活化状态的 μOR-BU72 晶体结构，Nb39 的晶体结构。

　　2、μOR-BU72 or μOR-DAMGO 的活化状态配体结合口袋的结构和氨基酸定位高度相似 → μOR 以一种不变的方式识别不同结构的兴奋剂。(Fig. 1c)

　　3、与 BU72 相比，DAMGO 的 N 端占据相似的结合口袋位点，但 C 端与 ECL 距离远 ~8??。(Fig. 1d, e)

　　4、分子动力学仿真，在 1?μs 里DAMGO基本保持不变。（图注中说明DAMGO频繁返回原始位点）(Fig. 1f, Extended Data Fig 5)

　　5、DAMGO 的 N 端与 D147^3.32形成稳固的盐桥，相同的氨基也经常与 Y326^7.43 形成氢键。(Fig. 1e）

　　6、μOR-BU72 的晶体结构显示出 DAMGO 的苯酚基与 H297^6.52 以两个水分子成桥，但仿真说明其中一个水分子迅速分离，稳定的配体结合需要单个水分子。这是一个 μ-/δ-/κ-OR 识别阿片类的标志。(Extended Data Fig. 6)

　　7、DAMGO 结合 μOR 比另两种的选择性强 500 倍，选择性在 μ-/δ-OR 主要取决于 ECL1 的残基，κ-OR 主要为 ECL3。

　　8、DAMGO 的 C 端图密度较 N 端稍弱，与仿真结果相应。(Fig. 1f, Extended Data Fig 5)

　　9、DAMGO 的 N(Me)Phe side chain 占据一个 ECL1 附近保守的疏水口袋，甘氨酸羟基回折向配体，这个模型和 μOR 与环形脑啡肽高度亲和一致。(Fig. 1e)

Structure of Gi-stabilized active μOR

　　1、相对于非活化状态，μOR-Gi 和以 Nb39 固定的 μOR-BU72 具有相似的 TM6 的向外位移（均方根偏差 1?）。(Fig. 2a, b)

　　2、大部分 GPCR 中大量的高度保守的残基表现出对受体激活的重要性，包括 D^3.49R^3.50Y^3.51, N^7.49P^7.50XXY^7.53，以及三核心（I^3.40, P^5.50, F^6.44）。这些结构在 μOR-Gi 中与 Nb39-μOR 复合物几乎完全一致。(Fig. 2c)