易基因｜一种全新的检测DNA羟甲基化的技术：ACE-Seq

Posted 2023-06-08 E-GENE

大家好，这里是专注表观组学十余年，领跑做组学科研服务的易基因。今天给大家介绍一种全新的检测DNA羟甲基化的技术：APOBEC-coupled epigenetic sequencing，简称【ACE-seq】。

 

前言

DNA序列中胞嘧啶（C）5’ 碳位结合一个甲基基团而转变成5mC的现象称为DNA基甲基化。在5mC去甲基化的过程中，其会被氧化成5hmC，这种新的修饰称为DNA羟甲基化。

如图

因为5hmC是5mC去甲基化的中间产物，所以对于多细胞来说，同一个C位点上不同细胞往往会存在5mC或5hmC不同修饰，而5mC与5hmC对基因表达的调控作用又完全不同：启动子区的DNA甲基化对基因表达的有抑制作用，DNA羟甲基化则会促进基因的表达。因此，对5mC及5hmC的水平进行精确地定量并分别研究十分有必要。

 

了解易基因的小伙伴肯定知道，易基因的看家本领OX-BS技术可以轻松的开展DNA羟甲基化的相关研究，虽然神器在手，但是不少老师反应，OX-BS研究羟甲基化成本还是过高，因为毕竟要两个文库结合，180G的测序数据都是白花花的银子啊。易基因的研发小伙伴牢记老师们的反馈，日以继夜的奋战终于在6月之际。推出新一代羟甲基化研究科研服务产品‍：APOBEC-coupled epigenetic sequencing ，简称(ACE-seq)。

 

ACE-seq是一种全新的检测DNA羟甲基化的技术，由美国宾夕法尼亚大学Emily K Schutsky等在2018年发表在Nature Biotechnology杂志上。不同于传统的BS-Seq，该技术使用AID/APOBEC家族DNA脱氨酶APOBEC3A (A3A)代替化学脱氨，保证了DNA的完整性。A3A能够特异地脱去C及5mC的氨基使其变为U，而5hmC则因为不被该酶识别，测序时仍被检测为C。这样，便将5hmC与C及5mC区分开来。

 

该技术原理示意图如下：

首先，利用T4 β-葡糖基转移酶（βGT）将5hmC转化成5ghmC，5ghmC不会被A3A酶脱氨基；然后，利用A3A酶特异去除C和5mC的氨基，使其转变成U，而5hmC保持为C，从而将5hmC和C/5mC区分开来。

 

ACE-Seq具有以下优势：

(1)检测范围为全基因组，可以得到基因组上大部分C位点的羟甲基化水平。

(2)单碱基分辨率。能够检测单个C碱基的羟甲基化水平，精确度高。

(3)低起始量。ACE-Seq利用脱氨酶实现5hmC与C及5mC的区分，反应条件温和，不破坏基因组，大大减少基因组DNA的损失，因此起始DNA量比常规的oxBS技术降低100倍。

(4)高准确性。绝大部分甲基化修饰的C都被转化成U，而绝大部分经过糖基化修饰的5hmC（5ghmC）则保持为C，表明该技术具有充分的可靠性。

 

如下图：

(5)经济性。仅需一个文库解决问题，羟甲基化研究成本大大降低。

 

ACE-Seq独有的优势使其在羟甲基化检测领域拥有巨大的潜力。‍

 

为了让大家全面理解掌握自己究竟该选择哪种羟甲基化研究技术，我们再来温习一下oxWGBS-Seq。该技术将传统的BS-Seq技术与化学氧化相结合，先利用高钌酸钾将DNA上的5hmC氧化成5fC，再用重亚硫酸盐处理，5fC和没有任何修饰的C就被转化成U，而5mC则不会被转化，仍然保持为C。

 

原理示意图如下：

(1)可以同时检测甲基化和羟甲基化的水平。

(2)检测范围为全基因组，可以得到基因组上大部分C位点的甲基化和羟甲基化水平。

(3)单碱基分辨率。能够检测单个C碱基的甲基化和羟甲基化水平，精确度高。‍

 

由于以上优点，oxWGBS被称为精准甲基化和羟甲基化检测的“金标准”。

根据oxWGBS还可以衍生出oxRRBS技术。oxRRBS是简化代表性重亚硫酸盐测序（RRBS-Seq）技术与化学氧化技术的结合，可以针对基因组上CpG含量高的区域（如CGI，启动子等重要的调控区域）进行甲基化及羟甲基化水平检测。由于oxRRBS只针对CpG含量高的区域进行检测，而这些区域往往是重要的调控区域，使得oxRRBS技术能够以较低的成本检测关键基因组区域的甲基化及羟甲基化水平。

 

然而以上两种技术有两个共同的缺点。

 

首先，由于重亚硫酸盐处理对DNA有强烈的破坏作用，导致建库过程中会损失大量DNA，因此该技术需要的DNA起始量较高；另外，由于该技术需要构建两个文库，会导致成本的上升。

此外，还可以利用hMeDIP-Seq技术来检测DNA羟甲基化。hMeDIP利用5hmC特异性抗体富集基因组上发生羟甲基化的DNA片段，结合高通量测序，检测基因组上羟甲基化的区域。

 

原理示意图如下：

该技术针对羟甲基化的片段进行测序和定量，成本大大降低。但该技术无法达到单碱基分辨率，也无法得到精确的羟甲基化率，只能得到羟甲基化修饰的信号强度。

看完上面的内容，羟甲基化研究领域和精准甲基化研究领域的小伙伴们知道该选哪种技术了吗？不清楚也没关系，易基因专业的科研团队随时待命给您提供最专业的技术咨询。

 

参考文献：

doi:10.1038/nbt.4204

 

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近些年以来，DNA甲基化研究一直是顶级期刊、基金资助、临床研究、药物研发上市的多重热点，其研究方向涵盖疾病发生发展、疾病标志物研究、环境因素暴露与响应、发育和分化等多维度。

研究人员为DNA甲基化课题申请作准备以及为降低DNA甲基化实验风险，通常会进行DNA甲基化研究的前期探索性实验，主要包括：

• 检测DNA甲基化酶和去甲基化酶的表达
• 检测整体DNA甲基化水平变化
• 其他前期实验

 

一、检测DNA甲基化酶和去甲基化酶的表达

方法包括：

• RT-qPCR检测mRNA表达
• Western blot检测蛋白质翻译

e.g. 高脂饮食组和肥胖人群中均观察到DNMT的RNA和蛋白质表达上调

 

二、检测整体DNA甲基化水平变化

方法包括：

• 5mC甲基化免疫荧光染色（定性）
• DNA斑点杂交（定性）
• 比色法（定量）
• 质谱法（定量）

斑点杂交（Dot blot）

免疫荧光显微观察

比色法/质谱法

 

三、其他前期实验

在没有条件开展甲基化相关前期实验的情况下，也可以开展其他预实验。包括：

• 关键表型指标测定
• 转录组（成本低廉）

 

以上就是关于DNA甲基化研究的前期探索性实验及研究思路分享，易基因科技提供全面的DNA甲基化研究整体解决方案，技术详情了解请致电易基因。

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