ATAC-seq实战 0 Tn5转座

Posted 2023-05-16

参考技术A

可移动的DNA片段即可移动因子 (Transposable elements) 在基因组上自由转移称为转座，DNA与所插入的基因位点可以是非同源的。转座是产生基因多样性的重要机制，可移动因子可产生插入 (insertion)，缺失 (deletion)，倒置 (inversion) 以及染色体融合突变 (chromosomal fusion mutations)。[1]

转座需要通过转座酶的催化完成。根据 1）转座酶与DNA是否形成共轭中间体和 2）蛋白质活性残基 可以将转座酶分为5类： tyrosine (Y), serine (S), relaxase (Y1) and rolling-circle (Y2) , 这4类是转座酶与DNA形成共轭中间体；而第5类称为DDE转座酶，是通过酯基转移反应完成的。[2]

DDE转座酶的催化中心是由三个分离的区域N2，N3和C1，分别含有天冬氨酸 (D)，天冬氨酸 (D) 和 1个谷氨酸 (E) 组成，虽然三个区域间有不同长度间隔区，但通过蛋白质折叠形成三联体参与催化。

原核生物的转座分为两种方式，复制转座和保守转座。复制转座的供体DNA完整，把通过复制的DNA片段插入基因位点上；保守转座则是从供体DNA上分离一段DNA，以转座酶作为中介，连接到目标DNA上而实现的 (又被成为 \'cut and paste\' 转座)。

Tn5是极好的模型来研究保守转座模式。

Tn5 Tnp 有476个氨基酸长； 属于IS4转座酶家族，其拥有YREK motif。
主要功能区：尾端DNA结合决定簇、二聚体结合域和活性位点 。

野生型 Tnp的主要特性是极不活跃 。在体外没有活性，而体内发生转座的概率仅为1/10^5细胞。通过 四种类型的突变可使活性提升 至少4个数量级：

1. 分离N端与 C端
以L372P为例，N端（含DNA结合域）与 C端（含二聚化结合域）相互抑制活性，导致这一现象的原因极有可能是两者之间距离太近。因此可以通过改变构象将两个结合域分离，从而提高活性。L372P是通过引入脯氨酸到靠近C端的α螺旋里，使得螺旋断裂，从而将C端拖离N端。

2. 提高Tnp与转座子末端的结合
以E54K为例，E54K提高了Tnp 与OE DNA的结合，而靠近 54残基的突变也可达到相似的提高效果。由此可见， DNA结合域的结构不是与OE 的结合的最优形态。其他研究表明，与IE 的结合也有相似的结论。

3. 形成直接的E-K相互作用，形成特定结构并与转座子末端的结合
E110 和 E345 残基通过形成 Mn++/Mg++盐桥。围绕在E345周围的残基（342，344 和348）能与末端DNA相结合， 说明110 和 345 残基形成的结构能够精准安排这个区域的残基与末端DNA结合。E110K或E345K的突变使得 110与345之间形成直接的E-K相互作用，由此削弱了盐桥的必要性。E-K相互作用可能改善了345区域结构而与末端DNA结合更易结合，或者在野生型Tnp中，没有足够的Mg++形成这个结构。

4. 提升形成 β-loop clamp的灵活性
242残基由P变为A/G将极大提高活性。这个突变提高了242-247在末端DNA上形成 β-loop clamp的灵活性。242的脯氨酸（P）是这的loop的基础，相较于丙氨酸（A）和甘氨酸（G），脯氨酸作为支柱更加牢固。

野生型Tn5转座酶是一种活性极低的蛋白质。这是因为要在宿主的生存和转座之间保持平衡。过多的转座将会导致基因功能的丢失。

组装过程是二聚体化的，双链DNA与转座酶的两个蛋白质亚基结合，引导转座子末端进入活性位点。[3]
酶与转座子结合→DNA切割 →目标捕获和链转移→分离与修复

1. 结合
由于没有明确的证据，结合过程可以 1）如图中所示，两个单分子Tnp分别与末端DNA结合，然后两个单分子再形成二聚体；2）亦或者是二聚体Tnp先与一端末端结合，再与另一末端结合；3）又或者是两种情况同时发生。

2. DNA切割
该阶段包括三个催化步骤：3\'链断裂，发卡结构的形成和发卡结构的断裂。
Tnp的活性位点DDE残基配位两个Mg++，这两个Mg++作为亲核试剂激活氧原子，使氧原子切断P-O键。

3. 目标捕获和链转移
在目标DNA捕获阶段，有一些序列产生偏移。由于两个3\'OH基团相距41 Å，要稍远与 所攻击的目标DNA两个磷酸二酯键之间9bp 的距离。故这两个3\'OH基团被镶嵌在一个可以容纳DNA的裂缝中，并且这个裂缝含有许多活性残基。DNA被捕捉到这个裂缝等待链的转移。
等DNA被捕捉后，两个3\'OH基团攻击位于目标DNA上相距9bp的磷酸二酯键，完成转座子DNA到目标DNA的转移。在体外时，链转移的两个末端并不同时发生。

4. 分离与修复
体外与体内转座的重大区别体现在链与转座复合物的分离。
在分离后会有两个9bp的缺口在两个末端。

python telnet后如何保存执行tn.write()命令输出的信息如何调用或者保存到txt文件中

def do_telnet(Host, username, password):

tn = telnetlib.Telnet(Host,timeout=10)
tn.set_debuglevel(2)

tn.read_until('Username: ')
tn.write(username + '\n')

tn.read_until('Password: ')
tn.write(password + '\r\n')

tn.read_until('\r\nsha-cat29poe'+'>')
tn.write('show mac address-table address '+ mac+ '\n')
tn.write('exit\n')

temp = tn.read_all()
macstr = str(temp[339:353])
已经解决了

参考技术A Host = '192.168.1.2' # Telnet服务器IP
username = 'admin' # 登录用户名
password = '123456' # 登录密码
finish = ':~$ ' # 命令提示符（标识着上一条命令已执行完毕）