文献(4): Nature子刊_晚期非小细胞肺癌的单细胞图谱

Posted 2023-03-27

参考技术A 下面我会简单介绍一下文献内容，涉及到以下内容，大家可能会感兴趣：

我们从标题中大概能知道这篇文献的主要工作是集中在晚期NSCLC的肿瘤异质性、肿瘤微环境。去年的统计数据显示肺癌已经是我国发生率和死亡率最高的癌症。
大家做单细胞的原因很多时候都是为了解决异质性的问题，为什么用药之后有的人有效而有的人没效，为什么刚开始有效过段时间又没效，这其中根本的原因就在于异质性，肿瘤细胞本身有异质性，周围的微环境也有异质性。最终的愿景是希望在完全了解透这些异质性后，能给患者分组，每一组给予特定的治疗方案。

这张图显示了这篇研究的样本组成，有肺腺癌 肺鳞癌，有三期 四期，他们是否吸烟，有无致癌突变。这个图的展示形式还挺清晰的。

左上图展示了鉴定出来的11种主要的细胞类型，需要注意的是，这里面把 Cancer 和 Epithelial 、 Alveolar 是区分开的，也就是说肿瘤取样也可能含有正常的上皮细胞。这篇文章里面鉴定肿瘤细胞，方法非常简单，首先得是上皮细胞(高表达EPCAM)，然后不表达肺部组织正常上皮细胞的marker。比我 之前讲的方法 简单多了，准确性如何呢，我持保留意见，不过下文的CNV热图我们可以看到有一些病人所有肿瘤细胞是几乎没有CNV的。
左下图是病人来源信息，从图中可以看出，这张图是没有去批次效应的。原因有两个：一是对于非肿瘤细胞的亚群，不同病人聚类比较好，二是在这张图中，不想抹掉肿瘤细胞的肿瘤间异质性。这是原文的解释，我也很赞同，所以当你遇到肿瘤细胞、非肿瘤细胞一起聚类的情况，可以不去批次。非肿瘤细胞单独拿出来聚类就另说了。
右边两张图就比较常规了，marker基因热图（之前总结过展示marker基因的几种图， 第一篇 、 第二篇 ），细胞亚群占比。

a图是根据腺癌、鳞癌，有无突变分组后，比较CNV（前面写过三篇inferCNV相关的帖子，学完可以画出更好看的CNV热图）。作者发现肺腺癌在chromosome 7 and 8q有扩增，在chromosome 10有缺失；肺鳞癌在3q有扩增，在5q有缺失。该结论并不是在所有病人中都成立。
b图c图一起看，C图是说这些肿瘤细胞可以聚成20类，b图说的是每一个病人中，每个cluster的占比。从b图可以看出在多数的肺腺癌中（图的右边1/3的样本）会聚到一起（很像），并且每个病人中只有一个主要的cluster；而肺鳞癌病人之间没有那么像，并且好几个病人有多个cluster。这说明肺鳞癌有更高的肿瘤间异质性，以及更高的克隆性。
这一部分是肿瘤间异质性：腺癌鳞癌之间，病人之间。

为了定量肿瘤内部的异质性(ITH)，作者定义了两个ITH分数，一个基于表达矩阵得到ITH_GEX，一个基于inferCNV输出的矩阵得到ITH_CNA。在矩阵中，所有细胞两两之间算一个相关系数，对于这些数值的分布，0.75分位数减去0.25分位数就得到这个分数。左图显示这两个ITH分数有一定的相关性，但不强，因为CNV虽然可以影响基因表达，但基因表达还受很多其他因素的调控，比如TF、小RNA、点突变、与周围环境的细胞互作等等。
右图比较了不同分组之间的ITH分数。

关于肿瘤细胞的拟时序，我见过正常上皮细胞和肿瘤细胞放在一块来分析的，几乎没有见过肿瘤细胞单独做拟时序，而且我也觉得这样做没什么道理，我觉得肿瘤细胞不同状态是一种优胜劣汰的关系，不同状态之间是否会相互转变感觉不是很明确（我没说EMT, CSC这种线性的转变），所以即使做了拟时序结果也不一定可靠。

这篇文章是第二种情况，以图中肺鳞癌为例。已知basal cells和club cells可以发展成LUSC肿瘤细胞，做完monocle2发现club cells处在更末端的位置，basal cells处在靠近club cells的枝干上，肿瘤细胞分布在其余位置，因此可以将已知的路径改写成：basal cells 似乎 是club cells向肿瘤细胞转变的中间状态（原文 似乎 这个词用得太好了，没把话说绝，也省了实验验证，我学废了）。

文章说这是首次在肺癌中找到Th17细胞亚群，并揭示了Th17和Treg潜在的转变关系（之前已经被报道过）。
d图是用Slingshot做的，颜色深浅表示拟时序的先后，Th17和Treg之间被连起来，说明存在转换关系。
右边的分支图和热图是monocle2画的，之前刚学monocle2的时候，比较疑惑的是热图里面的fate1和fate2分别表示什么，这张图就说得很清楚了。从你想研究的节点（图中的1节点）到根（一般是人为指定，图中是CD4 naive对应的状态）都是pre-branch，然后沿着拟时序的方向（跟你指定的根状态有关），右边的枝是fate1（对应图中的增殖细胞），左边的枝是fate2（对应Treg细胞）。热图里面选了一些pre-branch、fate1、fate2对应细胞的差异基因来呈现，从热图中间向两边看，能看到不同的fate表达不同的基因。文中说，从图中可以看出Th17是沿着naive到Treg的中间状态。
结合这两种方法，得出Th17和Treg有潜在的转变关系。

在解析了肿瘤细胞、重要免疫细胞之后，作者又看了每个病人中细胞亚群的占比，并探究了哪些因素能影响细胞占比。

a图是说，不同的分组影响中性粒细胞的占比，文章是将中性粒细胞作为一种免疫抑制的亚群来说的。
d图是说，随着异质性分数的增加，几种免疫抑制的亚群占比增加，浆细胞亚群占比减少。（浆细胞分泌抗体对肿瘤细胞有一定的杀伤作用，可以通过介导NK细胞，或是激活补体系统等途径，不过抗肿瘤免疫平时说得比较多的还是T细胞杀伤这种细胞免疫方式。）
因此作者得出结论，认为ITH升高，会增加免疫抑制微环境，降低肿瘤杀伤能力。

文章的最后一部分讲的是细胞通讯，虽然作者说不同的分组有不同的细胞间通讯网络，但从文中给的图来看，几组都整体差不多，有个别差异。
如果用过cellphoneDB，会发现输出结果里面有统计学意义的受配体对很多很多，之前比较两组的受配体对，试过肉眼比较两张大热图一个一个看，太花时间了，后来就干脆提前整理好想要比较的受配体对（文章里面经常出现的受配体对就那些），直接从输出文件里面提取，省事很多。
比如，我图中圈出来的几个，

最后总结一下，我觉得的这篇文章的亮点：

OK啦，这篇文献就说到这里，欢迎三连哈~