单细胞seurat包的原理解析

Posted 2023-05-06

参考技术A seurat涉及的数据分析包括很多步骤。
之前只顾着干活儿，也没有系统的整理过分析中的具体内容。
这里就参照网上大神们分享的帖子，来梳理一下。

这个函数就是根据输入矩阵/数据框，创建Seurat对象的。重要步骤是 设置 ident 和添加 meta.data。

*min.cells 表示一个基因至少要在3个细胞中被检测到，否则不要。
*min.features 参数指定每个细胞需要检测的最小基因数量。此参数将过滤掉质量较差的细胞，这些细胞可能只是封装了随机barcodes，而没有任何真实的细胞。通常，检测到的基因少于100或者200个的细胞不会被考虑进行分析。

这里还是设计一个知识点就是R里面的S3类和S4类。
list一般情况下被认为是S3类，S4类是指使用slots存储数据的格式。（如果说的不对欢迎中纠错）
这里读进去的数值是三个文本文件创建的稀疏矩阵。
什么是稀疏矩阵？
在[矩阵]中，若数值为0的元素数目远远多于非0元素的数目，并且非0元素分布没有规律时，则称该矩阵为稀疏矩阵；与之相反，若非0元素数目占大多数时，则称该矩阵为稠密矩阵。

如果自己手上有单细胞数据，那个matrix文件里面包含很多0。

因为在测序之前会对抓取到的RNA进行PCR扩增，所以需要考虑文库深度的对测序的影响，所以需要对上一步得到的稀疏矩阵进行Normalize。
Normalize的方式：每个细胞每个基因的特征计数除以该细胞的特征总计数，再乘以scale.factor（默认10000），然后使用log1p进行对数转换。（log1p=log(n+1)）
Normalize之后的数据储存在seurat[['RNA']]@data这里。

首先我们合并数据的时候一般直接用的是merge，所以不同样本的细胞的数值不会发生变化。

这里截取whitebird的解释。

做过传统转录组分析的家人们都明白，用转录组数据的FPKM和TPM绘制热图等等的时候，因为数值的变化范围太过巨大，都需要进行一个log转换，让数据压缩在一个区间。
其次，也是最重要的改变数据分布：测序数值本身不符合正态分布，log转换能让数据趋近于正态分布，方便后续的进一步分析。

高变异基因就是highly variable features（HVGs），就是在细胞与细胞间进行比较，选择表达量差别最大的基因，Seurat使用FindVariableFeatures函数鉴定高可变基因，这些基因在不同细胞之间的表达量差异很大（在一些细胞中高表达，在另一些细胞中低表达）。
默认情况下，会返回2,000个高可变基因用于下游的分析，如PCA等。

算法实现在 FindVariableFeatures.default() 中。
目的是在var~mean曲线中，不同mean值区域都能挑选var较大的基因。

单细胞基因表达counts矩阵数据经过NormalizeData()处理后，还需要进行scale。
[ScaleData()]函数将基因的表达转换为Z分数（值以 0 为中心，方差为 1）。
它存储在 seurat_obj[['RNA']]@scale.data，用于下游的PCA降维。
默认是仅在高可变基因上运行标准化。

最开始分析单细胞的时候，这里有点疑惑。
为什么前面已经Normalize，这里还要scale一下？
"Scaling与Normalization的区别"
scale改变的是数据的范围，normalize改变的是数据的分布。
scale是将数据的分布限定在一个范围内，这样子方便比较。normalize却是将偏态分布转换成趋近于正态分布。

这里引用“whitebird”所写的内容。
R语言的Z score计算是通过[scale()]函数求得，Seurat包中ScaleData()函数也基本参照了scale()函数的功能。

scale方法中的两个参数：center和scale

Z score的概念是指原始数据距离均值有多少个标准差。当以标准差为单位进行测量时，Z score衡量的是一个数值偏离总体均值以上或以下多少个标准差。如果原始数值高于均值，则 Z score得分为正，如果低于均值，则Z score为负。

Z score其实是标准正态分布（Standard Normal Distribution），即平均值μ=0，标准差 σ=1 的正态分布。SND标准正态分布的直方图如下所示：

Seurat使用RunPCA函数对标准化后的表达矩阵进行PCA降维处理。
默认情况下，只对前面选出的2000个高可变基因进行线性降维，也可以通过feature参数指定想要降维的数据集。
RunPCA之后会返回5个PC和对应的一大堆基因。
每个PC对应60个基因，分为Positive和Negative，各30个。
Positive和Negative就是PC轴的正负映射关系，正值为Positive，负值为Negative。
返回的是正值和负值绝对值最大的top30，可以理解为对所有细胞区分度最大的基因。

这是PCA之后得到的两个结果。
第一个是每个PC对应的基因。
第二个是每个细胞对应的PC上的坐标。
得到的PCA的结果还可以用以下两种方式来看。

首先计算每个细胞的KNN，也就是计算每个细胞之间的相互距离，依据细胞之间邻居的overlap来构建snn graph。
计算给定数据集的k.param最近邻。也可以选择(通过compute.SNN)，通过计算每个细胞最近邻之间的邻域重叠(Jaccard索引)和其邻近的k.param来构造SNN。

具体在计算细胞之间的距离的时候呢，用得到的KNN算法，即邻近算法。
但是，这个算法我也不太懂，但是其中有个事情还蛮有趣。
就是判定邻近的模块有两个：annoy、rann
其中这个annoy全称又叫做Approximate Nearest Neighbors Oh Yeah，名字还蛮可爱的。
下面这位博主对于这个算法有非常详细的解释，有兴趣的家人们自行前往观看。
FindNeighbors Seurat - (jianshu.com)

就是在已经计算完细胞之间的距离之后，对这些细胞进行分类。
可以指定分为几类细胞。
但是很多参考资料里面最重要强调的都只是一个参数：resolution。
resolution这个参数设置的大小决定了细胞类型的多少，值越大细胞类型越多。
具体分析的时候很多时候就会问：到底多少合理？到底应该分为几群？
其实对于测序的人来讲，很多时候确实也不太清楚到底有多少种细胞。
那就有两种解决办法。
1）直接看tSNE的图，物理距离就是判断的一种方法。当物理距离很近的一群细胞被拆开了，那就说明可能没拆开之前是合理的。但是，这种方法呢就简单粗暴一些。
2）有另外一个包clustree，可以对你的分群数据进行判断。
如下图中，当分为4、5和6群的时候，细胞之间没有太多的交叉，都是在进一步细分。
但是再往下，那些半透明的箭头就表示，从一个细胞群跑到了另外一个细胞群，说明就不太合适。

所以，参照上述两种判断方法，可以得到结果。

上述两种方法其实都是对数据进行降维。
为什么需要降维？

常见的降维方法有PCA (principle component analysis)、MDS (multi-dimensional scaling)、Sammon mapping、Isomap 、t-SNE （t-distributed stochastic neighbor embedding）和UMAP（Uniform Approximation and Projection method）。
其中PCA， t-SNE和UMAP在scRNA-seq中使用非常普遍。

之前的分析中已经用PCA降维了，为什么这里还要降维？

这两种方法有什么区别？
摘抄自：（ 跟着小鱼头学单细胞测序-scRNA-seq数据的降维和可视化 - 云+社区 - 腾讯云 (tencent.com)
）

处理完上述数据之后，可视化就很简单了。
具体的参数自行查阅。

以上。
欢迎查漏补缺。

Seurat | 单细胞分析工具

Seurat是一个老牌的单细胞分析工具了（satija的力作），我之前测试过，但是没怎么用。

最近发现这个工具又publish在了NBT上，所以很有必要看一下这篇文章。

 

Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species

主要目的：identifying subpopulations of cells that are present across multiple data sets

主要就是为了多样品之间的比较，甚至不同物种间的对比。

 

Overview of Seurat alignment workflow
We aimed to develop a diverse integration strategy that could compare scRNA-seq data sets across different conditions, technologies, or species.

 

Identifying shared correlation structures across data sets

Machine-learning techniques for ‘data fusion’ aim to integrate information from multiple experiments into a consistent representation.

 

待续~