转录组定量工具-featureCounts安装及使用

Posted 2023-04-24

参考技术A

        计算表达量可以用 StringTie、Htseq-count或featureCount ，第一次做转录组分析时，参照了一篇Cell的子刊文章的分析方法，里面使用的STAR+featureCount，就直接用了这个软件，也就没再使用别的，回头看第一次使用时，发现好多细节没有注意到，温故而知新。featureCount是subread软件包里的一个命令，所以安装subread即可。而subread又有命令行版和R版，有服务器，自然选择命令行版了。

featureCounts ，有两个核心概念：

       Feature: 指的是基因组区间的最小单位，比如exon;

       Metafeature: 可以看做是许多的feature构成的区间，比如属于同一个gene的外显子的组合。

       在定量的时候，支持对单个feature 定量(对外显子定量), 也支持对meta-feature进行定量(对基因进行定量)。当reads比对到2个或者以上的features 时，默认情况下，featureCounts在统计时会忽略到这部分reads, 如果你想要统计上这部分reads,可以添加-O 参数，此时一条reads 比对到多个feature，每个feature 定量时，都会加1。对于meta-features来说，如果比对到多个features 属于同一个 meta-features(比如一条reads比对到了exon, 但这些exon属于同一个gene), 则对于这个gene 而言，只会计数1次。 总之，不管对于 feature 还是 meta-feature, 只有比对多个不同的区间时，才会分别计数。

  首先是官方网站

        https://sourceforge.net/projects/subread/

        http://subread.sourceforge.net

-a 指定注释文件

-o 指定结果输出目录及文件名

-p 能用在paired-end的情况中，会统计fragment而不统计read

-t 指定feature的类型，默认是exon，当然gtf里面还有gene、CDS或者直接以feature命名的分类方式。

其它参数：

 -f 参数   该参数设置后统计的是 feature 层面（默认是 exon ）的参数，如果不设置则是直接统计 meta-feature 参数（即一个 gene 中的多个 exon ）

这时按exon分类进行统计，但是由于没有设置-f，在同一个gene内的exon会被统计成一个meta-feature，但是每个exon仍然会被显示出来，遇到一个gene有多个exon的时候看着就很乱。

第二种： 然后我加上-f，这样设置-t exon -f , 看一下结果：

        我现在还不确定-f参数及-t参数对后面差异表达会不会有影响，初步判断不会的，但我注意到，-t gene -f设置后，count计数基于gene 层面，就不会出现相同基因的不同外显子count值，也就是第一列不会出现重复，并且可以直接得到基因信息，避免了注释、删除重复这个过程，我们做转录组测序，不就是想看基因水平的变化吗，我觉得这是很好的一个参数设置，不知道为什么网上一堆的帖子都没有这样设置，官网上示例也只是-t exon。希望未来有人和我讨论一下这个问题。

最终：我基于自己的理解，加上-t gene -f参数了。

1 、运行过程情况：

        Successfully assignedalignments: 14212190 (32.7%), 说明只有32.7的paired reads 定量到了基因上，如果想知道那些没有分配上的reads是出于什么原因，则可看下图，输出中的summary文件。

     Unmapped: 没有比对上；     

     MultiMapping:多个序列比对在有限的序列区域上，即参考组上有多个匹配点； 

     NoFeatures: 其比对与任何基因都不重叠； 

     ambiguous: 其比对与多个基因重叠。

2. 合并不同样本的 count 文件：

        join count1.txt count2.txt > count_12.txt

        或者先提取出来每个样本的第一列和第七列信息，再通过join合并

        cut -f 1,7 count1.txt | grep -v ‘^#’ >count1_cut.txt

        这样就能得到所有的样本的Count矩阵了。

总结：使用这个工具时要根据不同的项目，不同的目的，参数也要进行适当的调整，尤其是模式生物和非模式生物研究时，一定要想想参数设置合适不合适，我不认为写好了一个流程，就可以用来做所有课题的转录组分析了。这也是自己会和交给公司来做最大的好处了，自己的课题，只有自己才能对数据结果负责。

附：

STAR有一个参数-quantMode，可以指定--quantMode GeneCounts输出STAR计算出的reads计数结果，如果是比对完之后未做转录本拼装，直接对已知基因（构建基因组索引时GTF中囊括的基因）进行定量时，完全不需要再次用featureCounts或HTSeq再计算reads count。以后试试。

参考：

https://www.jianshu.com/p/9cc4e8657d62

http://www.360doc.com/content/21/0714/12/76149697_986499746.shtml

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24227677/

http://subread.sourceforge.net/featureCounts.html

http://subread.sourceforge.net/RNAseqCaseStudy.html

转录组表达定量- Read count？CPM? RPKM? FPKM?

参考技术A

1.Read count

数值概念：比对到某基因的reads数。

用途：用于换算CPM、RPKM、FPRM等后续其他指标；同时作为基因异分析软件（如DESeq和edgeR）的输入值，也就是说差异分析的结果来自于 read count的计算，而非CPM、RPKM、 FPKM，表达定量的结果主要用于主成分分析、层次聚类分析。

2.CPM：Counts per million

数值概念：计算公式：CPM= A/mapped reads*1000000 A为比对到某基因的reads数（read count）。

用途：在某些情况下，只想了解每个基因被覆盖到的相对reads数，而不希望对其做长度校正，就会使用这个指标。

CPM只对read count相对总reads数做了数量的均一化。当如果想进行表达量的基因间比较，则不得不考虑基因长度的不同。如果进一步做长度的均一化，就得到了下面的RPKM、FPKM。

3.RPKM：Reads Per Kilobaseof exon model per Million mapped reads (每千个碱基的转录每百万映射读取的reads)

数值概念：计算公式：RPKM=(1000000*A)/( mapped reads *gene length/1000)

设A 为比对到某基因的 reads数（read count）。

RPKM法能消除基因长度和测序量差异对计算基因表达的影响，计算得到的基因表达量可直接用于比较不同样品间的基因表达差异和不同基因间表达高低的比较。

用途：用于与基因表达量相关的后期分析。基因表达趋势分析、WGCNA共表达网络构建，热图绘制等都使用。

4. FPKM : Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments(每千个碱基的转录每百万映射读取的fragments)

FPKM意义与RPKM极为相近。二者区别仅在于，Fragment与Read。RPKM的诞生是针对早期的SE测序，FPKM则是在PE测序上对RPKM的校正。只要明确Reads和Fragments的区别，RPKM和FPKM的概念便易于区分。Reads即是指下机后fastq数据中的每一条Reads，Fragments则是指每一段用于测序的核酸片段【双端序列即使丢弃1端reads，让按照1个Fragments计算】。