m6A分析流程＋背景知识

Posted 2023-04-15

参考技术A 用TRIzol，对总样品的RNA进行 分离和纯化 。然后用NanoDrop ND-1000对总RNA的量与纯度进行 质控 。再通过Bioanalyzer 2100对RNA的 完整性进行检测 ，同时通过 琼脂糖电泳的方案进行验证 。浓度>50ng/μL，RIN值>7.0，OD260/280>1.8，total RNA>1μg满足下游实验。加入 镁离子打断试剂盒 在94℃高温条件下对total RNA进行 片段化处理 5min。使用免疫磁珠与m6A抗体预混，将预混好的 m6A-免疫磁珠与片段化的RNA（含有核糖体RNA片段）进行IP ，从而得到IP产物。IP产物在 逆转录酶 的催化下合成 一链cDNA ，后加入接头进行 第一轮PCR --预变性94℃ 1min，98℃ 变性15s，55℃退火15s,68℃延伸30s,最后再保持68℃延伸2min，共5个循环，合成 二链DNA 。使用纯化珠将扩增的DNA文库进行 纯化 。将R-Probes v2探针和ZapR v2 酶加入到DNA文库从而达到 去除核糖体RNA反转录的cDNA序列 的目的--72℃ 孵育2min，4℃保持2min，37℃ 1h,72℃ 10min，最后4℃保持。通过 第二轮PCR 对最终文库进行扩增，PCR程序设置与第一轮一致，循环数增加至12-16个。最后，我们使用illumina Novaseq™ 6000 按照标准操作对其进行 双端测序 ，测序模式为PE150。

下机原始数据格式为fastq，我们首先使用 fastp （https://github.com/OpenGene/fastp）的默认参数对所有IP样本和Input样本下机原始数据进行 质控，包括去除接头、重复序列和低质量序列 ，得到 CleanData 用于后续分析。然后使用 HISAT2 （http://daehwankimlab.github.io/hisat2）将CleanData 比对 到基因组上（拉丁文： Mus musculus , 基因组版本：v101），再利用得到的 bam 文件使用R包 exomePeak2 （https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/exomePeak2.html）进行 Peak calling和diff Peak分析 ，并使用 ANNOVAR （ http://www.openbioinformatics.org/annovar/）对peak进行 注释 。最后使用 MEME2 （http://meme-suite.org）和 HOMER （http://homer.ucsd.edu/homer/motif）进行 motif分析 。 基因组装和定量软件为StringTie （https://ccb.jhu.edu/software/stringtie），定量方式为 FPKM （total exon fragments/mapped reads (millions)× exon length (kB)），并使用 R包edgeR （https://bioconductor.org/packages/edgeR）进行 差异分析 ，差异倍数FC（fold change）≥2或FC≤0.5且p值小于0.05。

MeRIP测序生信分析流程图

Reference:

[1] Chen S., et al . fastp: an ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor. Bioinformatics , 34(17): i884–i890 (2018).

[2] Smith A.. Falco: high-speed FastQC emulation for quality control of sequencing data. F1000Research , 8: 1874 (2019).

[3] Wang L., et al . RSeQC: quality control of RNA-seq experiments. Bioinformatics , 28(16): 2184-5 (2012).

[4] Kim D., et al . HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements. Nature Methods , 12(4): 357–360 (2015).

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[6] Bailey TL, et al . MEME Suite: tools for motif discovery and searching. Nucleic Acids Research , 37(Web Server issue:202-8): W202-8 (2009).

[7] Heinz S., et al . Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and b cell identities. Molecular Cell , 38(4): 576-89 (2010).

[8] Wang, K., et al . ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data. Nucleic Acids Research , 38(16): e164 (2015).

[9] Pertea M., et al . StringTie enables improved reconstruction of a transcriptome from RNA-seq reads. Nature Biotechnology , 33(3): 290–5 (2015).

[10] Robinson MD, et al . edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics , 26(1): 139-40 (2010).

2020年陈建军教授在Cancer Cell上发表的关于mRNA和non-coding RNA上m6A修饰的综述值得一读，联川进行了全文翻译：https://mp.weixin.qq.com/s/9lhlRAs425ePfclhfbvLqQ

如何剖析一个内核子系统

1.前言

本文档主要讲述如何去剖析一个内核子系统的常规方法

一般来讲比较全面的分析一个内核子系统，大概包含如下几个部分：

1）framework的整体介绍，包括基础知识、软件框架；

2）软件框架中涉及的组件的属性和API;

3) 分析主要流程，在分析流程的过程中加深对各个组件属性及API的理解

2.包含的主要部分

2.1 framework整体介绍

• 基础知识

阐述要理解本模块，需要具备的背景知识，如需要理解i2c子系统，则需要对i2c协议有相关的了解。

此部分可以专门单独列为一章阐述

• 硬件框架

一般给出硬件的框图架构，并对框图中相关的实体和接口给出解释

• 软件框架

给出软件的框图架构，并对组成软件框图架构的实体文件及它们之间的关联进行说明，也可以联系硬件框架给出相关的解释

2.2 组件的属性和API

• 介绍各个组件的属性和API

2.3 介绍主要流程

• 分析主要流程，在分析流程的过程中加深对各个组件属性及API的理解
• 主要流程可能是从上向下，从下向上，也可能是从中间到两边，可分别加以分析
• 要注意在介绍整个流程的时候不是对每个组件都统一着墨，而是只以其中一个组件为主

3. 遵循的重要原则

• 遵循先硬件后软件，先抽象后具体，结构与流程相结合的原则进行分析