WISECONDOR NGS 检测CNV 介绍

Posted 2023-05-16

参考技术A

低测序深度WGS数据无对照样本，检测新生儿染色体异常工具

产前检测，传统使用绒毛膜绒毛或羊水取样，进行核型分析。但是取样会造成约1%的流产概率。

研究表明，约3.4%~6.2%的胎儿cfDNA会出现在母亲的血浆中，且在整个基因组中呈现均一分布。这些片段已经足够用于检测胎儿的染色体异常。

目前使用NGS进行产前检测的一个缺陷是，每次在检测一组新的数据时需要配套检测健康的参考样本，以减少实验造成的影响，提高了检测成本。

本文介绍的这个工具开发了一种新的检测手段，通过样本内部的染色体片段频率的自我比较，解决实验上的浮动，从而可以实现，在低测序深度0.3fold，且无健康对照的情况下稳定可靠的染色体异常检测。

构建参考bins 需要一组正常的样本，来确立每一个bin对应哪些参考bin集合；

使用z-score计算，测试样本每个bin，相对于该样本自身的参考bin区域的read 频率差异——individual bin method；

使用滑动窗口范围内的所有单个bin z-score联合计算 Stouffer’s z-score —— sliding window method

z-score的计算公式

是测试样本第i个bin的偏离分值， 是测试样本bin i 中的read 频率， 是bin i在对应参考bin中的均值和标准差。当z-score ，该bin 被标注为潜在异常。

为提高灵敏度，当确认一个bin为异常时 ，该bin 被存在列表L中，然后重新计算所有bin的z-score（参考bin 移除L 中的bin） 。重复这一过程直到L 不变或达到设定次数。

为了移除过多的相邻检出，允许合并检出的区域，中间隔几个bin（gap），称为 MaxBinSkip （文章使用 2个bin）；此外，为了删除由几个碰巧彼此接近的峰值产生的检出，我们对发现的畸变bin的最小数量设置一个阈值MinLength（10 bins）。

individual bin method 灵敏度较低且易受峰值影响；

使用 Stouffer’s z-score 计算target bin附近的bins的z-score。

是在（silding window ）bin i 上的z-score，考虑的是bin i 左方v 个bins 和右方的v 个bins。

当 时判断为异常：

是使用sliding window 方式计算出的bin i 的状态。

当存在无法检测的bin 在sliding window 时，忽略这些点，所以减少了window 中bin 的数量。该方法同样使用MaxBinSkip 和 MinLength 。文章中使用的sliding window 大小为 11 个bins（每个bin 1M）。

非整倍体突变的检测也是基于亚染色体检测的结果。当出现非整倍体变异时，该染色体上几乎所有的bin都会被标注为异常bin。一般会用一个阈值T作为判断标准。

是染色体c 判断的结果， 是染色体c上所有可以用于检测的bin的数量，T是用户自己设定的阈值（本文0.5）。

假设母亲血浆样本中胎儿的DNA的含量是~5%，则应该能够检测到至少5%的读频差异来检测出一个染色体区域的拷贝数变化。

这里引入一个AvgASD（average allowed deviation over all bins）概念，每个tagert bin，计算其参考bin集合的reads 频率标准差，并除以target bin的reads 频率，得到了一个reads频率的最小相对变化值。当所有Tagrt bin 中这些值平均AvgASD > 0.05，结果就会被认为不太可靠，因为此时要检测出来变异需要超过5%的reads频率变化。

高AvgASD 与reads 覆盖度无关但是会带来大量假阳性结果尤其19号染色体，GC-normalization可以显著降低AvgASD。

文章取56名孕妇的血浆，并假设胎儿DNA占5%。使用hiseq2000 51bp单端测序，全基因组覆盖0.2~0.7 层，被测试的样本包含8个21三体、2个13三体、2个18三体、2个22三体和4例存在亚染色体缺失或dup。使用核型分析作为正确判断标准。测序结果使用mismatch1 拆分数据，map 基因组时不允许mismatch，超过一个map位置的reads会被丢弃。

为了除去部分异常高深度的reads，用一个特制的过滤方法，去除大量重叠reads的所有reads，只保留第一个read。bin大小 1Mb, 500kb,250kb and 100kb都分别做了测试。其中1Mb的结果比较稳定，更小的bin szie会引入噪音和大的差异。GC-normalization是用Biopythons LOWESS function on the GC-count and read depth per bin . 所有的步骤，都省略了性染色体，因为比对到X和Y上的reads数量和婴儿的性别强相关。

对于WISECONDOR来说，19号染色体的检测比较困难，很可能因为GC含量比较高，比较难找到参考bin。

WISECONDOR基于的假设是，样本的基因组大部分区域都是正常的，所以当大部分基因都有变异时就无法正确工作，比如三倍体。

参考文献：
Straver R, Sistermans EA, Holstege H, Visser A, Oudejans CBM, Reinders MJT. WISECONDOR: detection of fetal aberrations from shallow sequencing maternal plasma based on a within-sample comparison scheme. Nucleic Acids Res 2014;42:e31.

Pillar Biosciences的oncoRevealTM Dx肺癌和结肠癌NGS检测试剂盒获得FDA的上市前核准

马萨诸塞州内蒂克和中国上海--(美国商业资讯)--创新的下一代测序(NGS)解决方案体外诊断(IVD)公司Pillar Biosciences今天宣布，美国食品药品管理局(FDA)已向其oncoReveal™ Dx肺癌和结肠癌检测签发上市前核准(PMA)，这种基于组织的NGS伴随诊断检测试剂盒用于对源自非小细胞肺癌(NSCLC)和结直肠(CRC)癌症肿瘤的DNA体细胞突变进行定性检测。

oncoRevealTM Dx肺癌和结肠癌检测试剂盒的上市前核准依据经过临床验证的数据，允许该检测用作FDA核准的所有表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗药物的伴随诊断(CDx)，TKI治疗药物在NSCLC中靶向作用于EGFR突变（19外显子框内缺失和21外显子L858R替代突变），在转移性结直肠癌(mCRC)患者中靶向作用于KRAS野生型肿瘤组织（密码子12和13无突变），可在有必要使用Erbitux®（西妥昔单抗）或Vectibix®（帕尼单抗）进行靶向治疗的场合为临床医生提供指导。该检测适用于Illumina MiSeqTM Dx测序仪，后者是Illumina用于体外诊断检测的NGS平台。

Pillar Biosciences创始人、首席执行官宋钢博士表示：“我们致力于提供优质精准的检测IVD，以便为癌症患者做出更好的治疗决策。我们获得FDA核准的产品能用于任何开展NGS检测的实验室，让所有癌症患者都能获得精准医疗。”

Illumina首席战略和企业发展官Joydeep Goswami表示：“通过与Pillar Biosciences等合作伙伴的合作，增加我们各类Dx仪器的内容对患者的可及性，这是在践行我们通过释放基因组的力量来改善人类健康的使命。我们承诺与Pillar团队开展持续合作。”

Pillar Biosciences联合创始人、首席科学官王朝晖博士表示：“我们认为应在最靠近患者居住地的地方提供优质的专业检测，对于癌症患者而言尤其如此。我们期待加快我们未来的开发计划，并为社区环境中的诊疗提供者和合作伙伴带来更多经过FDA核准的创新产品。”

关于Pillar Biosciences

Pillar Biosciences是一家全球肿瘤精准诊断解决方案公司，其体外诊断(IVD)解决方案可提供精准、稳健、及时、临床可操作的洞见，以指导患者医护全程的治疗决策。我们的使命是让任意一间NGS实验室在离患者家更近的地方向所有患者提供优质平价的临床级的专业NGS检测。Pillar在马萨诸塞州内蒂克和中国上海设有分支机构。