无参转录组分析：使用 Trinity 进行转录本拼接（参考脚本）

Posted 2023-05-07

参考技术A 1，参考脚本：

nohup /home/zxd/software/trinityrnaseq-Trinity-v2.4.0/Trinity --seqType fq --max_memory 4G --CPU 1 --samples_file ../sample.txt --SS_lib_type RF >trinity.log 2>trinity.err &

2，链特异性参数设不对 结果全是错的

一.文库类型

转录组文库构建的时候，可以选择链特异性文库或非链特异性文库。

链特异性文库，我们清楚的知道得到的 reads 跟转录本是同向的还是反向的。

链特异性文库构建，有多种方法，最常用的就是基于 dUTP 的方法。

文库类型有两种表示方法。

第一种表示方法：

第二种表示方法：

二.参数设置

在数据分析中，最复杂、最容易出错、出错了影响最为严重的除了用错书记，就是搞错文库类型参数了。设置错了可能导致转录本很短、表达量极低、比对率极低等 。在数据分析的时候，一定要问清楚构建文库的实验人员。

常用软件的参数设置如下。

1. 转录本拼接软件

在进行转录本拼接的时候，需要考虑链特异性的问题。

1.1 Trinity

非链特异性 默认，不需要设置

链特异性 参数为：—SS_lib_type ，如果使用dUTP，值为 RF

1.2 cufflinks

非链特异性 —library-type fr-unstranded, 默认

链特异性 如果使用dUTP：—library-type fr-firststrand

2. 将 reads 比对到基因组的软件

2.1 tophat

非链特异性 —library-type fr-unstranded, 默认

链特异性 如果使用dUTP：—library-type fr-firststrand

2.2 hisat2

非链特异性 默认，不需要设置

链特异性 如果使用dUTP: —rna-strandness RF， 添加了该参数后，每条 reads 将在 sam 文件中出现 XS 的tag，‘+’ ‘-’ 代表该 reads 所在的转录本与基因组序列的关系。

2.3 STAR

STAR 的比对中，不需要手动设置文库类型的参数。

3.表达定量

表达定量软件根据比对的 sam 文件，计算 read counts，需要提供链特异性信息。

3.1 eXpress

非连特异性 默认，不需要设置

链特异性 如果使用dUTP：—rf-stranded

3.2 RSEM

RSEM 使用 --strandedness 参数设置 。

非链特异性 --strandedness none

链特异性 如果使用dUTP: --strandedness reverse

参考：本文来自 基因课，生物信息视频课程

转录组数据标准化--Normalization

参考技术A 转录组数据经过比对到参考基因组获得对应基因count值后，因为测序深度以及基因长度的关系，在进行差异分析之前，还需要进行标准化。标准化是转录组数据差异分析必不可少的一步。

用于转录组差异分析的目前主要是两个软件：Deseq2 和 edgeR；针对这两款软件，学习一下目前的应用的标准化方法。

通过针对每个样本获得对应的大小因子Cj来使不同样本的计数具有可比性，即使这些样本的排序深度不同。

首先先确定几个后续会使用的变量

具体计算函数如下：

cpm(..., normalized.lib.sizes = TRUE)       edgeR

原理：将库的大小作为标准化的一种形式是有直观意义的，因为将一个样本测序到一半的深度，平均会得到映射到每个基因的读取数的一半。

计算方法：

calcNormFactors(..…,method="upperquartile",p=0.75)      edgeR

原理：与规范微阵列数据的标准技术类似，本方法是根据分位数等参数匹配基因计数的样本间分布。例如，可以简单地按样本的中位数对其计数进行缩放。由于零和低计数基因的优势，中位数对不同水平的测序工作没有提供信息。相反，建议使用每个样本的上四分位数(75-第百分位数)。

计算方法： 1. 计算样本上分位数（75%）然后按库大小缩放读取计数

2. 重新计算总的reads count的上分位数

3. 计算Cj因子

calcNormFactors(..…, method ="RLE")           edgeR

estimateSizeFactors(...)          DESeq, DESeq2

calcNormFactors(..,method="TMM")       edgeR