插件 Hisat2+StringTie 本地界面化（Win/Mac），点点点，完成转录组数据分析

Posted 2023-04-30

参考技术A 早前，我已经通过插件的方式，让所有 TBtools 用户，都能完成 RNAseq 数据分析，从测序原始数据到基因表达量，使用的是一个曲线救国的策略，即直接使用 kallisto，跳过读段回帖，直接进行读段计数。
目前，更为常用的 RNAseq 上游数据分析流程，应该还是读段回帖之后进行读段计数。一般情况下，使用的软件是：star / hisat2。前者对内存要求高，而后者做了专门的层级索引设计，可以在个人电脑甚至是笔记本（比如我的笔记本 8G 内存）上完成绝大多数物种的转录组读段回帖。
于是，前几天对应的插件都开发出来了，即 hisat2-build 和 hisat2-align。走到这里，我们还能更进一步，做更有意义的事情。
早前的Kallisto本身是依赖于基因组基因结构注释的，其准确程度颇受已有注释的影响，而hisat2等基于回帖的，我们可以进一步做注释“自动校正”以及新转录本或基因挖掘。更为全面一些。这些，则往往常用的软件是 Stringtie。
Stringtie目前为止，并没有人编译windows版本（有点像 MCScanX 当初的情况），于是我做了尝试，调整了源码，并编译了（注：苹果用户 Mac 直接有可用程序，不存在这个问题）。折腾折腾，现在我们可以直接在 TBtools 里面进行转录组的有参考组装以及基于读段回帖的表达量估计。
于是，有必要整理一个教程，理清四个插件的使用，步骤如下：

插件直接从 TBtools 插件商店获取。主要到推荐从高速商店获取，参考前述推文《Plugin | 高速版插件商店！我又有一个绝妙的 idea》。

设置基因组序列文件，用于建立索引

点击Start，并等待即可

如此，即完成了索引构建。

总的来说，基本没什么特别要注意的，除非数据是链特异的，那么最好设置一下。另外是，是否很关注多匹配的reads，如repeat区域，那么可以考虑提高max hits。
恩，Threads 参数控制的是并行任务数目，而不是stringtie运行时的线程数。简单来说，假设输入的是 6 个样品，Threads设置为 2 ，那么同时会有最多两个样品在进行组装（即并行）。
输出结果会放置在输出目录下，

大体如下，

可能唯一需要注意的就是....并行任务数，可参考前述推文，其实常常也无需修改，一般按照电脑有多少个线程，保留2个，剩下的都可以用上试试。

示例数据只有一个样品，所以只组装出一个XXXX.assembly.gtf。无论有多少个输入样品，最终每个样品都会被独立组装，最后合并成一个 merged.stringtie.gtf。这个文件，可用于后续任何分析（亦即，完成了转录本组装）。

Stringtie 除了进行组装，还可以估算转录本以及基因的表达量。

按照要求设置文件即可，可能需要调整的就是read length，如果你想要得到 read counts，用于下一步差异表达分析的话。
运行后，可以看到在输出目录增加了 6 个文件。

插件均已上传至高速商店，

感兴趣地同样参考前述推文《Plugin | 高速版插件商店！我又有一个绝妙的 idea》

今天是大年初一 ~~~
新年新气象，
祝所有 TBtools 用户朋友，
牛年大吉！

HISAT2,StringTie，Ballgown处理转录组数据

HISAT2,StringTie，Ballgown处理转录组数据 

本文总阅读量次2017-05-26

HISAT2,StringTie，Ballgown处理转录组数据思路如下：

1. 数据质控
2. 将RNA-seq的测序reads使用hisat2比对
3. samtools将sam文件转成bam，并且排序，为下游分析做准备
4. stringtie对每个样本进行转录本组装
5. stringtie 将所有样本的转录本进行合并 注意：此处的mergelist.txt是自己创建的
6. 计算表达量并且为Ballgown包提供输入文件
7. Ballgown的安装 分析，需提供一个分组信息；

０．数据质控(QC)：
Ubuntu软件包内自带Fastqc,故安装命令apt-get install fastqc
fastqc命令：
fastqc -o . -t 5 SRR3101238_1.fastq.gz &
-o . 将结果输出到当前目录
-t 5 表示开5个线程运行
(四个样本，双端测序，要分别对八个fastq文件执行八次)

１．将RNA-seq的测序reads使用hisat2比对
准备软件：
安装HISAT2
下载地址：
http://ccb.jhu.edu/software/hisat2/downloads/
wget http://ccb.jhu.edu/software/hisat2/downloads/hisat2-2.0.0-beta-Linux_x86_64.zip -P ./
解 压 缩：
unzip hisat2-2.0.0-beta-Linux_x86_64.zip

准备文件：

1. 参考基因组序列；genome (chr.fa)
2. 参考基因组的注释文件;genes (chr.gtf)
3. Hisat2索引文件；indexes (chr_tran.1.ht2)
4. 测序数据；samples (chr_1.fastq.gz, chr_2,fastq.gz;样本表型信息 与 样本列表)

下载人类参考基因组和注释文件：
1.1 人类参考基因组：Hisat2官网上有Ensemble GRCh38的基因组索引, 链接：http://ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml
1.2 注释文件：下载自ensemble数据库ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-86/gtf/homo_sapiens
1.3 索引文件的创建:从gtf文件中构建索引，命定如下：
extract_exons.py hg19.annotation.gtf > exons.txt
extract_splice_sites.py hg19.annotation.gtf > splicesites.txt

创建索引另外一种方法：
hisat2-build [options]*<reference_in><ht2_base>

<reference_in>:用于指定参考基因组；

<ht2_base>:用于指定生成的索引文件的基名；

./hisat2-2.0.0-beta/hisat2-build -f ucsc.hg19.fasta –ss splicesites.txt –exon exons.txt -p 7 ./ucsc.hg19

#添加–ss和–exon选项后，需要很大的内存，build 人基因组的话需要200G RAM，如果没有这么大内存，不要添加这两个选项,但要在后续运行hisat时添加 –known-splicesite-infile选项（见下文）
如hisat2-build -f ucsc.hg19.fasta -p 7 ./uscs.hg19 ##大概需要一小时二十分钟

(1). 比对，生成bam文件：“将RNA-seq的测序reads使用hisat2比对对参考基因租组”
hisat2 -q -x ./ucsc.hg19 -1 reads_1.fastq -2 reads_2.fastq -S alns.sam -t

hisat2 -q -x ./ucsc.hg19 -1 reads_1.fastq -2 reads_2.fastq -S alns.sam –known-splicesite-infile splicesites.txt -t

-x :用于指定参考基因组所对应的索引文件；

-1, -2: 用于指定测序 Reads 所在的文件；

-S:用于指定存储比对结果的文件名；

-p: 用于指定线程数;

(2) Sort and convert the SAM files to BAM

samtools sort [email protected] 8 -o ERR188044_chrX.bam ERR188044_chrX.sam

[email protected]:用于指定线程数;

-o:用于指定存储转化结果的文件名；

注：*.bam 格式的文件为二进制文件；

在-b 指定的文件夹下生成特定的文件
e2t.ctab
e_data.ctab
i2t.ctab
i_data.ctab
t_data.ctab
e即外显子、i即内含子、t转录本；
e2t即外显子和转录本间的关系，
i2t即内含子和转录本间的关系，
t_data即转录本的数据

(3) assemble and quantify expressed genes and transcripts

stringtie -p 8 -G chrX_data/genes/chrX.gtf -o ERR188044_chrX.gtf -l ERR188044 ERR188044_chrX.bam

-G :用于指导组装过程的参考注释的文件；

-o:用于指定存储组装结果的文件名；

-l: 为转录本的ID指定前缀；

-p: 用于指定线程数;

(4) Merge transcripts from all samples:

stringtie –merge -p 40 -G chrX_data/genes/chrX.gtf -o stringtie_merged.gtf chrX_data/mergelist.txt

-G :用于指导组装过程的参考注释文件；

-o:用于指定存储组装结果的文件名；

-p: 用于指定线程数;

注： mergelist.txt 文件包含所有*.gtf 文件名的列表， 并且每个文件名占据一行。

(5) Examine how the transcripts compare with the reference annotation (optional)

./bin/gffcompare -r chrX_data/genes/chrX.gtf -G -o merged stringtie_merged.gtf

-r :用于指定参考的注释文件；

-o:用于指定存储结果的文件名的前缀；

-G:用于指定是否比较所有转录本（即使是冗余的）；

(6） Estimate transcript abundances and create table counts for Ballgown

stringtie -e -B -p 48 -G stringtie_merged.gtf -o ballgown/ERR188044/ERR188044_chrX.gtf ERR188044_chrX.bam

-e:用于指定是否仅为参考转录本估计表达丰度；

-B:用于指定是否输出 Ballgown table 文件；

-p: 用于指定线程数;

-G :用于指定已组装的注释文件；

-o:用于指定输出结果的文件名；