【单细胞转录组】将序列UMI映射到细胞聚类分群

Posted 2023-04-16

参考技术A

10X V5转录组vdj分析中，因为有 一段特殊基因序列比对不上参考基因组 ，所以bam文件没有这个barcode信息。需要把R2的这段序列，根据序列ID从R1中找出 R2序列与R1 barcode和UMI的 对应关系，然后做UMI去重，统计数量，然后再 映射到细胞聚类图中去看看这个序列的UMI表达量

根据文库结构

将目标序列作为比对参考模板，用R2文件进行blast比对，从比对结果中筛选出从3\'到5’方向的，因为10X V5转录组的R2的测序方向就是3’到5’，然后再筛选出比对上序列长度大于等于85nt的子集，获得比对上fastq R2测序文件的reads的ID信息， 再通过seqtk工具查询在 fsatq R1文件根据ID提取出相应的序列信息。

从查询出来的序列中提取序列前1到16nt获取barcode，17到28nt获得UMI信息，经过barcode和UMI的序列去重、统计、分群的标签映射

流程图：

序列模板---->R2 blast比对----->过滤&提取ID---->seqtk提取R1序列--->barcode和UMI的序列去重-->数据统计--->分群的标签映射---->UMI表达量可视化分析

R:

Linux:

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易基因-单细胞甲基化测序&单细胞转录组测序

大家好，这里是专注表观组学十余年，领跑多组学科研服务的易基因。

易基因单细胞甲基化测序&单细胞转录组测序

 

高通量单细胞DNA甲基化测序简介

单细胞DNA甲基化组学研究很大程度上受制于建库技术，传统的文库构建方法或类似于基因组DNA的单细胞扩增技术很难应用到甲基化实验过程中。目前单细胞甲基化研究主要受限于检测成本、不同细胞位点检测共有性差异等。

高通量单细胞甲基化scRBS技术指标：

• 起始量：单细胞；
• 高通量：上百成千个单细胞快速高通量甲基化检测；
• 数据量：单细胞1G测序数据；
• 覆盖度：每个单细胞覆盖4-10M的CG位点；
• 重复性：不同单细胞CG位点覆盖重复性可到达50%以上；
• 分辨率高：单碱基分辨率；
• 性价比高：单个细胞检测费用低至千余元。

多个单细胞检测CG位点的重复性高度一致

 

单细胞转录组测序（smart-seq2）简介

Smart-seq2技术在单细胞水平对带Poly（A）的RNA进行全长转录组扩增及高通量测序，能够满足高灵敏度、低偏好性的cDNA扩增，得到全长转录本，实现高水平的序列模板转换。

 

Smart-seq2技术有较好的覆盖范围，可检测到稀有转录本，无需额外的专业设备，应用范围较广，可以解决传统 RNA 定量技术在早期胚胎发育、干细胞、癌症、免疫等研究领域中存在的样品量极低或细胞异质性的问题，是在单细胞水平研究基因表达强有力的工具，极大地拓展了RNA-seq 的应用范围。

 

技术优势：

• 起始量低：1-1000个细胞或10pg-10ng total RNA即可高效扩增；
• 转录本覆盖度高：通过双端引物扩增全长cDNA，获得全转录组信息，避免3’端和5’端偏好性，产物完整性好；
• 检测灵敏度高：大幅度增加了低表达基因的检出量;
• 碱基分辨率高：可达单碱基分辨率，且可以定位到具体基因的具体转录本;
• 实验可控：质控点多，可从实验的开端判断细胞状况。

 

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