Sample Preparation by Easy Extraction and Digestion (SPEED) - A Universal, Rapid, and Detergent-free

Posted 2021-03-22 ilifeiscience

期刊名：Mol Cell Proteomics

发表时间：（2019年12月）

IF：4.828

单位：德国Robert Koch 研究所

物种：多种

技术：新蛋白提取和酶解方法

 

一、 概述：

本文设计了一种仅需要三步——酸化，中和及酶解——就能完成蛋白提取和酶解的实验方法，命名为简单的蛋白提取和酶解法（SPEED）。SPEED使用三氟乙酸（TFA）做裂解液，适用于不同类型的样本，包括难以裂解的样本类型。文章评估了SPEED方法对大肠杆菌，小鼠肝脏和金黄色葡萄球菌的效果，又将该方法与5种不同原理的蛋白提取方法做比较。结果表明SPEED操作简单，成本低廉，蛋白定量重复性高，增加了蛋白质组学的检测深度，在必要时可以大幅度缩短实验时间。SPEED比使用去污剂、离液剂的蛋白提取方法有优势。

 

二、 研究背景：

基于质谱的蛋白质组学研究多使用bottom-up方法，将蛋白质从样本中提取出来，酶切成肽段，再用质谱仪进行检测。常用的蛋白质提取和酶解方法各有优势和不足之处。例如液态酶解法操作步骤少，方法简便，重复性好，但是不适用于动植物组织、革兰氏阳性菌等较难裂解的样本。本文设计了一种新的样本制备方法SPEED，克服了液态酶解法的缺陷又保留了它的优势。

 

三、实验设计：

 

 

四、研究成果：

1、SPEED方法流程包括三步，1)用强酸TFA裂解样品，释放出蛋白质，2)用2M的Tris Base中和酸性，3）用胰酶将蛋白消化成肽段。肽段经过线上或线下除盐后，上液相-质谱平台进行检测。TFA能在1min内彻底溶解大肠杆菌细胞， 10min内彻底溶解小鼠肝组织，但金黄葡萄球菌细胞则需在加入TFA后，额外用微波照射10s来溶解。

 

 

 

2. 用SPEED方法制备的大肠杆菌和HeLa肽段样品，未除盐样品（在上机时线上除盐）和用stage tip除盐的样品上机检测的结果比较：a)总离子色谱图的强度和出峰时间相近；b)未除盐样品的蛋白鉴定数少1-3%，肽段鉴定数少7-11%；c)-e)蛋白定量重复性，变异系数和Pearson相关系数的结果相近。

 

3. 作者在SPEED方法的基础上建立了filter-aided SPEED方法，又将酶解时间从20h减少到了1h或15min，使整个filter-aided SPEED流程的时间减少到82min或37min。作者比较原版SPEED方法（stage tip，酶解20h），filter-aided-酶解20h, 1h, 或15min四种方法，发现使用原版方法得到的蛋白和肽段略多一些。四种方法的蛋白定量稳定性和重复性表现相似。

 

4. 比较SPEED方法与另外三种蛋白提取酶解法在不同类型样本中的效果。文章从蛋白提取率，肽段和蛋白的鉴定数，蛋白定量，酶解，肽段修饰这几个方面对四种方法进行了比较。SPEED的综合表现优秀，主要的优势在于提升了样本的蛋白定量重复性和蛋白质组测序深度。

 

5. 用SPEED方法从包含20株人体微生物的混合样本中提取和酶解蛋白，和iST, STrap两种样本处理方法的效果作比较。SPEED处理的样本，蛋白和肽段鉴定数(a)以及蛋白的绝对定量值(b)都远超另外两种方法，在革兰氏阳性菌中表现明显。这表明用SPEED方法处理难裂解的细菌样本，效果比去污剂和物理裂解的组合方法效果好。

 

五、文章亮点（结论讨论）：

    本文设计了一种新的蛋白提取和酶解方法SPEED。不同于广泛的使用去污剂或离液剂与物理裂解的组合，作者另辟蹊径，用强酸溶解细胞膜，释放蛋白，达到裂解的效果。虽然SPEED在破裂细菌细胞壁时需要额外的辅助，作者也没有展示此方法对植物组织的应用，但SPEED在细胞，微生物和动物组织样本中的应用效果很好。

 

 

阅读人：李思奇