测序数据基本信息

Posted 2023-04-03

参考技术A

在测序过程中，Illumina内置软件根据每个测序片段（read，通常每个片段长100个碱基）前25个碱基的质量决定该read是保留还是抛弃。如果没有 达到质控标准 ，则该read的全部碱基都被抛弃；达到标准、保留下来的数据叫做PF data。 PF代表pass filtering。

Illumina内置软件根据统一设定的标准来评判碱基识别结果的可靠性，为每个碱基给予一个质量评分（QV）。PF data里质量评分>=30分的数据称为Q30 data。 Q30的意思是该碱基的可靠性为99.9%。Q30数据通常占PF数据的80%左右。视样本质量、操作水平、试剂质量、仪器状态的不同，这一比例有很大波动。

chapter1.高通量序列实验简介：设计与生物信息学分析

参考技术A

2021/4/16

1、设计高通量测序实验的步骤
2、介绍了最广泛使用的应用，并描述了基本的测序概念。
3、可用于生物信息学分析的各种软件程序，以理解测序数据。

1、Insert ：用于测序的DNA片段
2、Read ： Insert 被测序到的部分
3、Single Read（SR） ：一种只从 Insert 序列一端测序的测序程序
4、Pair Read（PR） ：一种从 Insert 序列两端测序的测序程序
5、Flowcell ：连接DNA芯片并进行测序的一种小玻璃芯片。 Flowcell 被探针覆盖，允许与DNA片段连接的接头杂交。
6、Lane ： Flowcell 由8个物理分离的通道组成，称为 Lane 。在所有 Lane 上并行进行测序。
7、Multiplexing/Demultiplexing ：在同一 Lane 上对几个样本进行测序称为多路复用 Multiplexing ，在一条 Lane 上测序的 Reads 的分离称为分路复用 Demultiplexing ，通过一个识别每个Reads*的索引将其与已知样本的索引进行比较。
8、Pipeline ：一系列的计算过程

（一）reading
   1、Resequencing ：在一个给定的样本中找到相对于参考基因组的变体
     实验细节 ：从相关细胞中提取DNA，进行由DNA碎片化和测序组成的样品制备
     基本分析总结 ：将序列片段映射到参考基因组，并通过总结片段与其基因组位点的差
           异来识别相对于参考基因组的变异对应的“地图”

   2、Target-enriched sequencing ：靶点富集测序是一种特定的 Resequencing 形式，只
    关注特定的基因组基因座。
     实验细节 ：在从细胞中提取DNA并进行样品制备后，进行一个富集过程来捕获相关的
         位点，靶富集可以使用“定制的”靶富集探针在基因组的特定区域进行，或
         使用可用的试剂盒，如exome-enrichment kits。
     基本分析总结 ：与 Resequencing 相同

   3、De novo assembly ：识别一个基因组序列，而无需任何额外的参考
     实验细节 ：与 Resequencing 相同
     基本分析总结 ：组装过程依赖于DNA片段的重叠。这些重叠被合并成一致序列，称为
            contigs 和 scaffolds 。

（二）counting
   1、ChIP-Seq/RIP-Seq ：找到RNA或DNA结合蛋白的结合位置
     实验细节 ：（1）首先，进行了ChIP/RIP实验：蛋白质与DNA/RNA结合，并与之交
            联。然后DNA/RNA被分裂。
         （2）蛋白质 pull down 经历免疫沉淀过程，交联被逆转
         （3）对富集于蛋白结合位点中的DNA/RNA片段进行测序
     基本分析总结 ：被序列排列的片段被映射到基因组中。基因组中丰富的位置是通过检
           测基因组的映射片段的“ peaks (峰)”发现的,这些峰值应该明显高于在
           周围的位点中已映射的片段，并且与对照样本相比要高得多----通常
           是ChIP实验的输入DNA或其他由非特异性抗体进行的免疫沉淀样
           本。

   2、RNA-Seq ：检测和比较基因表达水平
     实验细节 ：从细胞中提取总RNA，在样品制备过程中，mRNA被 pull down 并破碎。
         然后，mRNA片段被逆转录成cDNA，cDNA片段测序。
     基本分析总结 ：cDNA片段被映射到参考基因组中。映射到每个基因的片段被计数和
           标准化，以便比较不同的基因和不同的样本。在一个RNA-Seq实验
           中，通过检测映射到一个未注释区域的基因组上的片段束，可以找到
           未标记的基因和转录本。

（三）reading/counting
   microRNA-Seq ：检测和计数 microRNAs
     实验细节 ：从细胞中提取总RNA，通过识别大多数已知的microRNA分子共同的自然
         结构来分离microRNA，然后对microRNA片段进行逆转录和测序。
     基本分析总结 ：被测序的片段被映射到基因组中，然后，微RNA可以被检测和计数。

1、在 reading 中，覆盖范围对应于 平均覆盖基因组中每个碱基 的 reads 数量。

一般来说， 30X覆盖率 被认为是识别基因组变异的最小值，而 de novo 通常需要一个更高的覆盖范围。

2、在 counting 中，覆盖的概念并不简单，因为the number of reads along the genome is not expected to be uniform.
  可帮助评估是否有足够的reads序列的分析是“ *saturation report* (饱和度报告)”，使用所有的reads确定表达水平，表达水平与 取一部分reads重新计算的表达水平 比较。

1、基因组的重复性
  要唯一地对重复区域的read映射进行评分，它必须 比 重复区域 或 边界相邻的非重复序列 更长。更长的reads或PE reads允许“拯救”非唯一端，也映射到基因组中的非唯一区域。

2、差异剪接变异
  同一基因表达的转录本不同时：

3、测序样本与参考基因组的遗传距离
  如果被测序的样本与参考基因组有遗传距离，可能需要更长的reads来确定基因组中每个read的来源。

4、寻找结构变异
  基因组的结构变化，如长的插入或缺失，倒位和易位可以通过Paired-End信息找到。

5、De Novo 装配
  挑战：测序错误、低复杂度区域和重复区域等
  更长的PE reads会导致更好的装配，使用一些具有不同insert length的序列库可以改进组装过程。

1、 Resequencing：有遗传距离。。。
2、RNA-Seq：使用来自不同重复的数据，并将其合并为一个具有更高统计显著性的值。
3、ChIP-Seq：+控制样本

1、Raw Data 处理
  此步骤的可用软件：Illumina’s CASAVA software，Illumina运行会生成“base-calling”文件(*.bcl)，它们只有在转换为通用fastq格式时才会非常有用,在此文件转换过程中，还执行解复用过程，即从同一lane上排序的不同样本分离读取。

2、质量控制和read操作
  此步骤的可用软件：CASAVA和FastQC
  测序运行完成后，在开始分析之前，应检查运行的质量是否以下参数，这些参数可能说明样品和运行的质量。

3、为De Novo Assembly组装 Contigs 和 Scaffolds
  此步骤的可用软件：SOAPdenovo，ABySS，Velvet，ALL-PATHS

4、mapping
  此步骤的可用软件：BWA ，Bowtie，TopHat

5、 Variant Calling and Filtering
  此步骤的可用软件： SAMtools，GATK，MAQ
  帮助检测变异的两个基本参数如下：
  （1）Coverage at the loci
  （2）被测序的等位基因的频率

6、Assembling Transcripts

7、 Gene Expression Analysis
  此步骤的可用软件：Cufflinks，Myrna
  一种常见的归一化方法FPKM，计算如下：

8、 Peak Detection
  此步骤的可用软件：MACS，SICER