SDS-PAGE相关知识

Posted

tags:

篇首语:本文由小常识网(cha138.com)小编为大家整理,主要介绍了SDS-PAGE相关知识相关的知识,希望对你有一定的参考价值。

参考技术A 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)作为聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的一种,可测定蛋白质的分子量,对蛋白质组分进行分离、分析、纯化、定性、定量以及少量的制备。在 蛋白表达 中有着广泛应用,尤其是在 大肠杆菌表达系统 中,有着不可替代的作用。 (服务请咨询)

1.SDS-PAGE的类型

在SDS-PAGE中,由于蛋白质与SDS结合后都带负电,因此是阳极电泳。

与常规聚丙烯酰胺凝胶电泳相似,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳也可分为圆盘电泳、垂直平板电泳和水平平板电泳。其中平板电泳较常使用。

  SDS-PAGE一般来说不采用连续电泳方式,因为在SDS-PAGE中蛋白质间不存在电荷密度差异,多采用不连续电泳方式。不连续电泳中蛋白质的分离主要取决于其分子大小和形状。不连续电泳的分离胶可以是均一胶,也可以是梯度胶。

2.SDS-PAGE的原理

  对于SDS-PAGE,由于在电泳体系中加入了十二烷基硫酸钠(SDS)和强还原剂(如巯基乙醇,二硫苏糖醇等),其中SDS作为阴离子去污剂会破坏蛋白质的氢键和疏水相互作用,导致蛋白质构象改变,而巯基乙醇等可以打开蛋白质分子内的二硫键,使其分解为亚基,因此电泳过程中蛋白质的生物活性丧失或减弱,但电泳后可恢复或部分恢复其活性。

  在离子强度低时,主要以单体形式存在的SDS可以与蛋白质结合,生成蛋白质-SDS复合物。由于SDS带有大量负电荷,复合物所带的负电荷远远超过蛋白质原有的负电荷,这使得不同蛋白质间电荷的差异被掩盖。而SDS-蛋白质复合物形状都呈椭圆棒形,棒的长度与蛋白质亚基分子量有关,所以在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白只存在分子大小的差别,利用这一点可将不同的蛋白质分开 (分子筛效应),因此SDS-PAGE常用于检测蛋白质亚基的分子量及鉴定纯度。

  与常规PAGE类似,不连续SDS-PAGE对蛋白质的分离除了基于分子筛效应外,还基于其对样品的浓缩效应。

3.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的实验方法

  样品缓冲液中须含有3~4倍于蛋白质的SDS以及足够断裂二硫键的β-巯基乙醇或二硫苏糖醇,而且蛋白须完全变性展开。由于每克伸展的蛋白质结合1.4g单体SDS,因此通常在样品缓冲液中加1%~2%(10~20g/L)SDS,在凝胶及电泳缓冲液中加0.1%SDS。

制胶

  SDS-PAGE多采用不连续的电泳方式,其制胶方法与常规PAGE的制胶方法基本一致,但由于凝胶中含有SDS,容易起泡,低温下又易结晶析出,因此单体储备液不需抽气,聚合时的凝胶也不适宜在4℃放置。制胶模具的准备也同常规PAGE相同。下面就介绍不连续电泳中的阳极电泳的制胶方法。

(1)凝胶储备液的配制

① 丙烯酰胺储备液T=30%,C固定,2.6%~3%。

② 4×分离胶缓冲液 如pH=8.8、1.5mol/L Tris-HCl缓冲液,含0.4%SDS。

③ 4×浓缩胶缓冲液 如pH=6.8、0.5mol/L Tris-HCl缓冲液,含0.4%SDS。

④ 10%过硫酸铵溶液(AP)。

注:丙烯酰胺是神经毒剂,应戴手套操作。电泳时的试剂应达到电泳纯,并使用重蒸水配制溶液。

(2)分离胶配方

A液/ml B液/ml 重蒸水/ml 10%AP/μl TEMED/μl

x/30×10=x/310/4=2.510-x/3-2.5约503~5

  根据聚合的快慢来调节AP和TEMED的用量,使凝胶在20~60min内聚合。

(3)制备浓缩胶

制备样品和加样

  5×样品缓冲液:pH=6.8、0.06mol/L (0.4mol/L)Tris-Hcl缓冲液,含25%(50%)甘 油、2%(10%)SDS、5% (体积分数)巯基乙醇和0.1%溴酚蓝。

  将蛋白质溶液与5×样品缓冲液以4:1(体积比)的比例混合(如果蛋白质溶液浓度过高,需预先脱盐处理)后,在100℃水浴中加热3~5min,使蛋白质充分变性,再于10000r/min离心5min,取上清加样。

电泳

  电泳缓冲液:pH=8.3,0.025mol/L Tris-0.192mol/L Gly缓冲液,含0.1%SDS。

1、带有烷基化作用的还原SDS处理:碘乙酸胺的烷基化作用很好的并且长期的保护SH基团,得到较窄的谱带;另碘乙酸胺可捕集过量的DTT,以防止银染时的纹理现象。

染色和检测

(1)考马斯亮蓝法,在SDS-PAGE后,凝胶的固定和染色时间应比常规PAGE的长1倍左右,或用多倍体积染色液染色,以排除SDS的影响。

(2)银染法,在电泳后染色之前,必须将凝胶多次漂洗,以除去SDS。

4.影响分离结果的因素

缓冲系统

  在SDS对蛋白质的助溶作用以及负电荷的包裹作用影响下,蛋白质的分离仅依据亚基的分子大小,因此缓冲系统的选择比较简单,只要利于分离并保持蛋白质的稳定以及不与SDS发生相互作用即可。常用的缓冲系统有 Tris-Gly缓冲液,其余如磷酸缓冲液(多用于连续电泳)、Tris-醋酸盐缓冲液、Tris-硼酸盐缓冲液、咪唑缓冲液以及SDS-尿素系统 (用于分离低分子量蛋白样品)。离子强度一般为0.01~0.2mol/L。

  SDS-PAGE为阳极电泳,在凝胶缓冲液中加入 0.1%SDS,在样品缓冲 液中加1% ~2%SDS和1%~6%巯基乙醇 (或3%二硫苏糖醇),并加适量溴酚蓝,在电极缓冲液中加0.1%SDS,不连续电泳的凝胶缓冲液和样品缓冲液中还需加适量甘油。

凝胶浓度

  由于凝胶浓度决定凝胶孔径大小,而凝胶孔径影响电泳效果 (即凝胶的分子筛效应)。特别是对于SDS-PAGE,由于电泳分离只取决于SDS-蛋白质亚基胶束的大小,因此凝胶浓度的选择尤为重要。应根据样品中蛋白质的分子量范围选择合适的凝胶浓度

C=2.6% C=5%

凝胶浓度(T)/%分子量范围/kDa凝胶浓度(T)/%分子量范围/kDa

5

10

15

20

25-200

10-70

<50

<40

5

10

15

20

60-170

20-100

10-50

5-40

Mysql相关知识点汇总

MySql 相关知识点


提示:本文是学习 丁奇老师《Mysql实战 45 讲》的个人总结

文章目录


前言

将 MySql 学习的相关内容形成若干篇文章,以加深印象


一、日志相关

1.查询的流程

连接器、分析器、优化器、执行器

2. WAL 技术

Write-Ahead-Logging 先写日志,后写磁盘。(日志是顺序写,速度快,磁盘是随机写,速度慢)

当需要更新一条记录时,InnoDB 引擎会把记录写到 redo log 里,再更新内存。这时更新操作就结束了。

通常在后台不忙的时候,InnoDB 引擎会把这个操作记录,写到磁盘上。

redo logg 用于保证 crash-safe ,数据库异常重启后,数据不丢失。
innodb _flush_log_at_trx_commit 设置为1,表示每次事务的 redo_log都直接持久化到磁盘。

INSERT INTO T (id, k) VALUES(id1,k1),(id2,k2)

假设 k1 所在的数据页在内存中,k2 的不在内存中

更新语句做如下操作

  1. Page1 在内存中,直接更新
  2. Page2 不在内存中,在 change buffer 中记录下,要往 Page2中插入一条数据
  3. 将上面两步的内容,记录到 redo log (图中 3 和 4 )
    做了这些,事务就结束了,成本很低,写了两次内存,之后写了一次磁盘,且是顺序写。图中的箭头是后台操作,不影响更新时间。

如果随后执行查询操作

SELECT * FROM T WHERE k IN (k1, k2);


Page1在内存中,直接读取即可,
Page2 从磁盘读取,结合 change buffer,在内存中生成正确数据。

  • redo log 主要节省的是,随机写磁盘的IO消耗(转为顺序写)。
  • change buffer 主要节省的是,随机读磁盘的IO消耗。

3. binlog 与两阶段提交

更新一条数据,大概流程

  1. 内存中找到这行数据,不存在就加载,
  2. 写入新行,更新内存
  3. 写入 redo log,状态为 prepare
  4. 写入 binlog
  5. 更新 redo log 状态为 commit

sync_binlog 设置为1,表示每次事务的binlog都写入磁盘,保证数据库异常重启时,binlog不丢失

4. 刷脏页(flush)

当内存中数据页跟磁盘上数据页内容不一致时,这个内存页叫**“脏页**”。

什么情况下会刷脏页:

  1. redo log 要写满了。
  2. 系统内存不足,需要淘汰一些数据页,这些数据页若是脏页,要 flush。
  3. Mysql 认为系统空闲的时候。
  4. Mysql 正常关闭时。

刷脏页是常态,但要刷的脏页太多,或是日志写满时,都会明显影响性能。

innodb_io_capacity 建议设置为磁盘的 IOPS。

如果一个查询,需要在执行过程中先 flush 掉一个脏页,这个查询就比平时慢了。如果这个脏页相邻的数据页,也是脏页,就连带着一起刷掉,那该查询就会更慢。 innodb_flush_neighbors 为 1 ,有连带机制, 为 0 禁止连带机制。


二、隔离相关

1.隔离级别

  • read uncommitted
  • read committed
  • repleatable read
  • serializable

读已提交 和 可重复读 逻辑类似,主要区别:

  • 可重复读的隔离级别下,事务开始的时候,创建一致性视图,事务中的语句共用这一个视图。
  • 读已提交隔离级别下,每个语句执行前,都会算出一个新的视图。

2.MVCC

InnoDB 中的每个事务,都有一个事务ID,叫 transaction id,它是在事务开始时,向 InnoDB 申请的,按申请顺序严格递增的。

每行数据也有多个版本,每次事务更新行数据时,会生成一个新的数据版本,并把 transaction id 赋值给这个新版本的数据,记作 row_trx_id。 undo log 可以实现不同数据版本的追溯。

对于一个事务版本来说,除了自己更新总是可见外,有三种情况

  • 版本未提交,不可见。
  • 版本已提交,且在视图创建前提交的,可见。
  • 版本已提交,但在视图创建后提交的,不可见。

在可重复读的场景下:

  • 读值的逻辑


事务A,高水位是100,读取 k 的值时,当前版本 101,大于其最高水位,回溯到上一个版本,
版本为102,大于其最高水位,再回溯到上个版本,版本号为90,小于最高水位,读该值。

  • 更新的逻辑


更新数据都是先读后写,而这个读,只能读当前值——当前读 current read。

事务B中 set 语句时,先是当前读,k 值 为2(如果事务C没有提交,阻塞),再赋值,k 值为3,同时生成新的数据版本,row_trx_id 为 101。 之后 B 事务中 get 判断版本号是 101,与自身版本号相同,可见。

select 语句加锁也是当前读。

SELECT * FROM TABLE WHERE ID = 1 LOCK IN SHARE MODE    -- 共享锁
SELECT * FROM TABLE WHERE ID = 1 FOR UPDATE   -- 排它锁

特别说明: C事务如果没有提交,根据两阶段锁协议,C 事务会占着锁,B 事务的当前读就会阻塞,直到C事务提交,释放了锁,B 事务继续执行。

可重复读的核心是一致性读(consistent read),事务更新数据时,一定是当前读,即一定要拿到锁。当该行的行锁被其它事务占用时,需要进入锁等待。

在读已提交模式下:

A 事务读到的 k 值是2,B 事务的修改对 A 不可见,因为 创建视图前没有提交。

总结:

  • InnoDB 的行数据有多个版本,每个版本有自己的 row_trx_id。
  • 每个事务或语句有自己的一致性视图。
  • 普通查询是一致性读,根据 row_trx_id 和 一致性视图,确认版本可见性。
  • 当前读,必需拿到锁才会执行,读当已提交完成的最新版本。拿不到锁就阻塞。
  • 可重复读,查询只承认事务启动前就已提交完成的数据。
  • 读已提交,查询只承认语句执行前就已提交完成的数据。

3.幻读

repleatable read 可重复读,在这个隔离级别下,说说幻读的问题。

幻读在当前读时才会出现,幻读专指插入新行。

为解决幻读问题,InnoDB 引入了间隙锁(Gap Lock),

间隙锁的引入,虽然解决了幻读的问题,可容易引起死锁,影响并发度。

简单的处理方法,就是把数据库的隔离级别设置为:读提交,且把 binglog 格式设置为 row。
(读提交级别,会有数据与日志不一致的问题,binlog 设置为 row,可避免这个问题。)

间隙锁与间隙锁之间,不会有锁冲突。

读已提交 和 可重复读 逻辑类似,主要区别:

  • 可重复读的隔离级别下,事务开始的时候,创建一致性视图,事务中的语句共用这一个视图。
  • 读已提交隔离级别下,每个语句执行前,都会算出一个新的视图。

三、索引相关

1.常用索引模型

  • .哈希表: 适用于等值查询的场景,范围查询就需要全量扫描。
  • 有序数组:等值查询和范围查询非常优秀,插入数据时,成本很高。
  • 搜索树:读写性能都比较好,O(log(N))

2.InnoDB 索引

B+树,叶子结点存储数据,其它节点存id。
回表:在非主键索引上找到主键ID,以此ID在主键索引上再查找数据,叫回表。
覆盖索引:在非主键索引上查询时,需要的字体,该索引上本来就有,不需要回表。
最左前缀:指建立联合索引时,索引字段是有顺序的。where 条件命中最左侧的一个或N个字段,就可以命中索引。
索引下推:使用到联合索引时,where条件中的字段,在该索引中,就不需要回表,直接用索引里的字段值,做相应判断,叫索引下推。

3.chang buffer

当需要更新一个数据页时,若数据页在内存里,直接更新即可。如果不在内存里,在不影响数据一致性的前提下, InnoDB 会将更新缓存在 change buffer 中,就不需要从磁盘中读取这个数据页了。访问这个数据页会触发merger操作,后台线程也会定期merge,关闭数据库时,也会merge.

如果能将更新先记录到 change buffer,减少随机读取磁盘,可以提升性能。而且,数据读入内存,需要占用 buffer pool,所以这种方式还可以避免占用内存,提高内存使用率。

比如插入一条数据时,目标数据页不在内存中,普通索引可以使用 change buffer,不用读磁盘。唯一性索引不能,因其必需判断索引的唯一性,要读磁盘,将数据页读入内存。

对于写多读少的业务场景,change buffer + 普通索引,可提高性能。

反之,如果一个业务写入后要立马读取,会触发 merge,且要访问磁盘,不会提高性能。

4.merge 操作的流程

  1. 从磁盘读入数据页到内存(老版本的数据页)
  2. 从change buffer 找出该数据库的 change buffer 记录(可能有多条),依次应用,得到新的数据页
  3. 写 redo log, 包括数据页的变更和 change buffer 的变更

至此 merge 操作结束,此时数据库和 chang buffer对应的磁盘位置都未修改,属于脏页。刷脏页属于另外一个过程了。

5.mysql 选错索引

优化器会选择索引,会考虑多个方面,如扫描行数据、是否使用临时表、是否排序等因素。

扫描行数的判断,Mysql 执行查询前,是通过索引的区分度来估计扫描行数的。

mysql 统计信息不准,可以用 analyze table 来修正

选错索引的处理方法:

  • 强制选定一个索引,force index
  • 新建一个合适的索引,或是删除错误的索引
  • 修改sql 语句,如 order by a limit 1 改成 order by a,b limit 1 (文章中的例子,这里不写上下文了)

四、锁相关

1.全局锁 FTWRL

Flush tables with read lock,该命令全使整库处于只读状态。
典型使用场景:整库进行逻辑备份

2.表级锁

表锁 和 元数据锁 MDL
表锁的例子 lock tables t1 read, t2 write
MDL(metadata lock)
读锁与读锁,不互斥
读锁与写锁,写锁与写锁之间,互斥
事务中的MDL锁,在语句执行时,开始申请,事务提交时,才会释放。

如何安全的给一个小表加字段?
小表也可能是热点表,加字段时要申请MDL写锁,没查没拿到,会阻塞,后继这个表读写操作都会被阻塞。
比较安全的做法是,申请MDL锁时,设置等待时间,如果没拿到,就放弃,不阻塞后继其它线程的读写操作。

ALTER TABLE tbl_name NOWAIT add column …
ALTER TABLE tbl_name WAIT N add column …

命令 show processlist ,若 出现 Waiting for table metadata lock
即表示 有线程 请求可持有 MDL 锁,其它线程会被阻塞。

3.行锁

两阶段锁:InnoDB事务中,行锁是在需要的时候加上,在事务提交时释放。并不是在不需要时释放。

所以在事务中要锁多个行,把最可能造成冲突的,最影响并发的放在最后。

出现死锁有两种处理策略:

  1. 直接进入等待,直到超时, innodb_lock_wait_timeout 来设置超时时间。
  2. 发起死锁检测,发现死锁后,主动回滚其中的一个事务。 innodb_deadlock_detect 设置为 on

4.next-key lock

一个间隙锁 + 行锁 构成所谓的 next-key lock,其为前开后闭区间。
(间隙锁是可重复读级别下才有效,本段内容默认在可重复读的级别下)

加锁规则,有人总结为两个原则,两个优化,还有一个 bug

  • 原则1:加锁的基本单位是 next-key,(前开后闭区间)。
  • 原则2:查找过程中,访问到的对象才会加锁。
  • 优化1:索引上的等值查询,给唯一索引加锁时,next-key 会退化为行锁
  • 优化2:索引上的等值查询,向右遍历且最后一个不满足条件时,next-key 会退化为间隙锁。
  • 一个bug:唯一索引的范围查找,访问到不满足条件的第一个数据为止。

以这个建表语句为例


CREATE TABLE `t` (
  `id` int(11) NOT NULL,
  `c` int(11) DEFAULT NULL,
  `d` int(11) DEFAULT NULL,
  PRIMARY KEY (`id`),
  KEY `c` (`c`)
) ENGINE=InnoDB;

insert into t values(0,0,0),(5,5,5),
(10,10,10),(15,15,15),(20,20,20),(25,25,25);

案例1:等值查询间隙锁

  • 根据原则1,加锁单位是 next-key,sessionA 加锁范围是 (5, 10];
  • 同时根据优化2,索引上的等值查询,最后一个退化为间隙锁,得到最终加锁范围 (5, 10)

案例2:非唯一索引等值锁

  • 非唯一索引,访问 c=5 这行后,会再访问 c = 10 才会停止,(0, 5], (5, 10],都会加锁
  • 根据优化2,最后一个退化为间隙锁,最终加锁范围是 (0, 10)
  • 上面两条并没有在 主键索引上访问,根据原则2,仅在非唯一索引上加锁, session B 访问的是主键索引,所以没有被阻塞

额外说明下,若是 用 for update ,系统会认为之后有更新操作,会给主键索引上加锁

案例3:主键索引范围锁

  • session A 访问 id = 10时,最终退化为 行锁,即给 id = 10 这条数据加锁
  • 范围查询,继续访问到 id = 15,不符合条件,next-key 加锁 (10, 15]

注意 sission A 访问 id = 10时,是等值判断,访问 id = 15 时,是范围判断。

案例4:非唯一索引范围锁

  • session A 访问 c = 10 时,加锁范围是 (5, 10],唯一索引时,会退化为行锁,c 不是唯一索引
  • 范围查找,访问 c = 15 时,才会停止访问,对 (10, 15] 加锁,范围查找,没有优化,最终加锁范围是 (5, 15 ]

案例5:唯一索引范围锁 bug

  • 按原则1,在主键索引上,查到 id = 15 就该停止了,加锁范围是 (10, 15]

但 InnoDB 实现上,继续又往右扫描了一行,(15, 20] 这个范围也给锁住了。

算是 bug 么?官方没有修正它。

案例6:非唯一索引上,存在等值

加一条数据,此时 c = 10 就有两条数据


mysql> insert into t values(30,10,30);


索引c 上加锁范围如下

案例7:limit 语句加锁

案例6 还有个对照案例,

这个带limit, 扫描到第二个 以= 10 就停止了,加锁范围小一些。

所以说,删除数据时,尽量加上 limit ,可以控制删除的条数,还可以减小锁的范围。


五、排序与优化

1.order by 的工作原理

假设有客户信息表的定义如下。要查询城市为杭州的,且按姓名排序,返回前1000个人的姓名和年龄。


CREATE TABLE `t` (
  `id` int(11) NOT NULL,
  `city` varchar(16) NOT NULL,
  `name` varchar(16) NOT NULL,
  `age` int(11) NOT NULL,
  `addr` varchar(128) DEFAULT NULL,
  PRIMARY KEY (`id`),
  KEY `city` (`city`)
) ENGINE=InnoDB;

// 查询语句可以这么写

select city,name,age from t where city='杭州' order by name limit 1000  ;

Mysql 会给每个线程分配一块内存,用于排序。这块内存叫 sort_buffer。

这条排序的SQL,执行流程大概如下:

  1. 初始化 sort_buffer,确定放入 city, name, age 三个字段。
  2. 从索引 city,中取第一个满足条件 city = ‘杭州’ 的主键 id。
  3. 用上步中的 id,在主键 id 索引中,取出整行数据,将 city, name,age 三个字段放入 sort_buffer中
  4. 从索引 city 中,取第二个符合条件的id,重复 步骤 2 和 3 ,直到条件不满足为止
  5. 对 sort_buffer 中的数据,按 name 做快速排序。
  6. 取排序结果的前 1000 返回

    其中按 name 排序,若数据量小,直接在内存中完成。若数据量大,则借助磁盘临时文件来完成。

上面例子中,只返回name和age两个字段,若返回的字段特别多,
即 sort_buffer 中行数据很大时,Mysql 会采取另外一种策略进行排序。

  1. 初始化 sort_buffer,确定放入 name, id 两个字段
  2. 从索引 city,中取第一个满足条件 city = ‘杭州’ 的主键 id。
  3. 用上步中的 id,在主键 id 索引中,取出整行数据,将 name,id 两个字段放入 sort_buffer中。
  4. 从索引 city 中,取第二个符合条件的id,重复 步骤 2 和 3 ,直到条件不满足为止。
  5. 对 sort_buffer 中的数据,按 name 做快速排序。
  6. 取排序结果的前 1000行,并拿 对应的 id,到原表中取 city,name,age三个字段返回。

    这两种排序,也体现了 Mysql 的设计思想:如果内存够,就多利用内存,尽量减小磁盘的访问。

2.优化相关

对索引字段做函数操作,可能会破坏索引的有序性,优化器会放弃使用树的搜索功能。

比如索引字段的隐式转换,字符集转换都可能引起索引失效

五、其它

1.数据空洞与表重建

参数 innobd_file_per_table

设置为 ON 表示,每个表数据存储在,以 idb 为后缀的文件中
设置为 OFF 表示,表数据放在系统共享表空间,跟数据字典放在一起

删除一条数据,innodb 会把该条记录标记为删除,文件并没有减小。
或是删除整个数据页,那整个数据页被标记为可复用。

删除数据可造成数据空洞,插入数据也会。

如果一个表,需要清除空洞,收缩表空间,可用 alter table A engine = innoDB 命令
大致流程如下:


此过程中 表 A 不能有更改,不是 on Line 的

2.count(*)

  • MYISAM 表 count(*) 很快,但不支持事务
  • show table status 返回快,但结果不准确
  • InnoDB 表 count(*) 结果很准确,但性能有问题

按效率排序 count(字段)<count(主键 id)<count(1)≈count(*),

建议,尽量使用 count(*),它做了优化,语义是“取行数”。

总结

以上是关于SDS-PAGE相关知识的主要内容,如果未能解决你的问题,请参考以下文章

GWAS相关知识

IMU的相关知识

redis相关知识点

数据仓库 数据中心相关技术知识和生态相关了解

数据仓库 数据中心相关技术知识和生态相关了解

类的相关知识