chapter1.高通量序列实验简介：设计与生物信息学分析

Posted 2023-03-30

参考技术A

2021/4/16

1、设计高通量测序实验的步骤
2、介绍了最广泛使用的应用，并描述了基本的测序概念。
3、可用于生物信息学分析的各种软件程序，以理解测序数据。

1、Insert ：用于测序的DNA片段
2、Read ： Insert 被测序到的部分
3、Single Read（SR） ：一种只从 Insert 序列一端测序的测序程序
4、Pair Read（PR） ：一种从 Insert 序列两端测序的测序程序
5、Flowcell ：连接DNA芯片并进行测序的一种小玻璃芯片。 Flowcell 被探针覆盖，允许与DNA片段连接的接头杂交。
6、Lane ： Flowcell 由8个物理分离的通道组成，称为 Lane 。在所有 Lane 上并行进行测序。
7、Multiplexing/Demultiplexing ：在同一 Lane 上对几个样本进行测序称为多路复用 Multiplexing ，在一条 Lane 上测序的 Reads 的分离称为分路复用 Demultiplexing ，通过一个识别每个Reads*的索引将其与已知样本的索引进行比较。
8、Pipeline ：一系列的计算过程

（一）reading
   1、Resequencing ：在一个给定的样本中找到相对于参考基因组的变体
     实验细节 ：从相关细胞中提取DNA，进行由DNA碎片化和测序组成的样品制备
     基本分析总结 ：将序列片段映射到参考基因组，并通过总结片段与其基因组位点的差
           异来识别相对于参考基因组的变异对应的“地图”

   2、Target-enriched sequencing ：靶点富集测序是一种特定的 Resequencing 形式，只
    关注特定的基因组基因座。
     实验细节 ：在从细胞中提取DNA并进行样品制备后，进行一个富集过程来捕获相关的
         位点，靶富集可以使用“定制的”靶富集探针在基因组的特定区域进行，或
         使用可用的试剂盒，如exome-enrichment kits。
     基本分析总结 ：与 Resequencing 相同

   3、De novo assembly ：识别一个基因组序列，而无需任何额外的参考
     实验细节 ：与 Resequencing 相同
     基本分析总结 ：组装过程依赖于DNA片段的重叠。这些重叠被合并成一致序列，称为
            contigs 和 scaffolds 。

（二）counting
   1、ChIP-Seq/RIP-Seq ：找到RNA或DNA结合蛋白的结合位置
     实验细节 ：（1）首先，进行了ChIP/RIP实验：蛋白质与DNA/RNA结合，并与之交
            联。然后DNA/RNA被分裂。
         （2）蛋白质 pull down 经历免疫沉淀过程，交联被逆转
         （3）对富集于蛋白结合位点中的DNA/RNA片段进行测序
     基本分析总结 ：被序列排列的片段被映射到基因组中。基因组中丰富的位置是通过检
           测基因组的映射片段的“ peaks (峰)”发现的,这些峰值应该明显高于在
           周围的位点中已映射的片段，并且与对照样本相比要高得多----通常
           是ChIP实验的输入DNA或其他由非特异性抗体进行的免疫沉淀样
           本。

   2、RNA-Seq ：检测和比较基因表达水平
     实验细节 ：从细胞中提取总RNA，在样品制备过程中，mRNA被 pull down 并破碎。
         然后，mRNA片段被逆转录成cDNA，cDNA片段测序。
     基本分析总结 ：cDNA片段被映射到参考基因组中。映射到每个基因的片段被计数和
           标准化，以便比较不同的基因和不同的样本。在一个RNA-Seq实验
           中，通过检测映射到一个未注释区域的基因组上的片段束，可以找到
           未标记的基因和转录本。

（三）reading/counting
   microRNA-Seq ：检测和计数 microRNAs
     实验细节 ：从细胞中提取总RNA，通过识别大多数已知的microRNA分子共同的自然
         结构来分离microRNA，然后对microRNA片段进行逆转录和测序。
     基本分析总结 ：被测序的片段被映射到基因组中，然后，微RNA可以被检测和计数。

1、在 reading 中，覆盖范围对应于 平均覆盖基因组中每个碱基 的 reads 数量。

一般来说， 30X覆盖率 被认为是识别基因组变异的最小值，而 de novo 通常需要一个更高的覆盖范围。

2、在 counting 中，覆盖的概念并不简单，因为the number of reads along the genome is not expected to be uniform.
  可帮助评估是否有足够的reads序列的分析是“ *saturation report* (饱和度报告)”，使用所有的reads确定表达水平，表达水平与 取一部分reads重新计算的表达水平 比较。

1、基因组的重复性
  要唯一地对重复区域的read映射进行评分，它必须 比 重复区域 或 边界相邻的非重复序列 更长。更长的reads或PE reads允许“拯救”非唯一端，也映射到基因组中的非唯一区域。

2、差异剪接变异
  同一基因表达的转录本不同时：

3、测序样本与参考基因组的遗传距离
  如果被测序的样本与参考基因组有遗传距离，可能需要更长的reads来确定基因组中每个read的来源。

4、寻找结构变异
  基因组的结构变化，如长的插入或缺失，倒位和易位可以通过Paired-End信息找到。

5、De Novo 装配
  挑战：测序错误、低复杂度区域和重复区域等
  更长的PE reads会导致更好的装配，使用一些具有不同insert length的序列库可以改进组装过程。

1、 Resequencing：有遗传距离。。。
2、RNA-Seq：使用来自不同重复的数据，并将其合并为一个具有更高统计显著性的值。
3、ChIP-Seq：+控制样本

1、Raw Data 处理
  此步骤的可用软件：Illumina’s CASAVA software，Illumina运行会生成“base-calling”文件(*.bcl)，它们只有在转换为通用fastq格式时才会非常有用,在此文件转换过程中，还执行解复用过程，即从同一lane上排序的不同样本分离读取。

2、质量控制和read操作
  此步骤的可用软件：CASAVA和FastQC
  测序运行完成后，在开始分析之前，应检查运行的质量是否以下参数，这些参数可能说明样品和运行的质量。

3、为De Novo Assembly组装 Contigs 和 Scaffolds
  此步骤的可用软件：SOAPdenovo，ABySS，Velvet，ALL-PATHS

4、mapping
  此步骤的可用软件：BWA ，Bowtie，TopHat

5、 Variant Calling and Filtering
  此步骤的可用软件： SAMtools，GATK，MAQ
  帮助检测变异的两个基本参数如下：
  （1）Coverage at the loci
  （2）被测序的等位基因的频率

6、Assembling Transcripts

7、 Gene Expression Analysis
  此步骤的可用软件：Cufflinks，Myrna
  一种常见的归一化方法FPKM，计算如下：

8、 Peak Detection
  此步骤的可用软件：MACS，SICER

测序与芯片高通量数据挖掘与分析学习班

生物信息学（bioinformatics）定义：是在大分子方面的概念型的生物学，并且使用了信息学的技术，这包括了从应用数学、计算机科学以及统计学等学科衍生而来各种方法，并以此在大尺度上来理解和组织与生物大分子相关的信息。

培训目的：

        很多老师都做过测序或者芯片实验，虽然测序公司已经给出了一部分的数据分析，比如过滤、质控、比对、定量和差异等，但是这些分析属于基础傻瓜式的标准分析，并不能完整的讲一个故事！因此，需要我们自己掌握高通量数据挖掘的能力，从海量信息中获得自己想要的关键基因！

培训预期：

  通过2天的培训，使学员掌握生信文献分析思路和8个实用操作知识点（具体见最后），可以独立完成一篇基于公共数据库的高通量数据挖掘分析。

生物信息学魅力：

帮助预测疾病相关的潜在基因，以及该基因潜在的作用靶点、上游调控转录因子等，从而指导实验方向、缩小试验范围、简化试验流程。

         为基金申请提供支持，通过强大的信息数据的收集整理，减少投入增强研究目的性；且通过整合技术优势，指导提高临床诊断水平。

        丰富的免费的数据资源和生物软件工具：数据库：NCBI, EBI, DDBJ, PDB,SWISS-PROT等；软件工具：Cytoscape，BLAST,  R语言，String,  David等。

案例：

该文献的分析流程如下图所示：

我们可以看到该文献主要的分析步骤有：差异表达分析、聚类热图构建、GO和KEGG 通路分析、蛋白互作网络分析、生存曲线分析等。我们的主题基本上按照类似的文献思路进行讲解，和大家一起分享一下一篇SCI文章的生信分析步骤。

 

通过2天的学习，我们可以掌握一篇生信SCI文献的所有分析模块，并可以独立的结合自己的研究方向进行生信分析和数据挖掘，获得一套属于自己的分析结果。

第一天上午第一节：基因数据库使用介绍

测序标准报告的解读。

NCBI Gene数据库：最权威的基因综合数据库之一。

NCBI GEO数据库：数据量最大的高通量公共数据库。

GEO2R工具：在线做差异分析的R工具

bioDBnet：在线基因ID转换工具。

Uniprot：最权威的蛋白综合数据库之一。

 

第一天上午第二节： DAVID工具——功能富集分析

         功能富集的原理和意义

基因ID转换

         基因功能注释（GO ，KEGG pathway）

         基因功能富集（GO ，KEGG pathway）

         基因功能聚类（GO ，KEGG pathway）

        

第一天下午第三节 聚类热图及pathwaymap图

KEGG 数据库：最权威的通路数据库（pathway map 分析）

HEMI软件：构建聚类热图的本地软件

 

第一天下午第四节. STRING工具——基因/蛋白相互作用分析（PPI）

         蛋白互作分析的原理和意义；

         单个蛋白的蛋白互作分析；

         多个蛋白的蛋白互作分析；

         STRING工具的使用步骤：输入、参数设置、输出等。

 

第二天上午第五节 cytoscape网络做图软件（上）

         网络图构建

         逐个修改节点的属性和修改边的属性

         网络展示方式layout更美观

         网络统计分析

        

第二天下午第六节  cytoscape网络做图软件（下）

         批量修改节点的属性和修改边的属性

         Cytoscape的常用插件：ClusterONE

         Cytoscape的常用插件：BinGO

第二天下午第七节  答疑环节

通过该主题的学习，可以学会：

1. 高通量公共数据的详细信息查找/下载；

2. 在线做差异表达分析

3. 在线blast分析

4. 基因ID转换

5. 通路map图制作

6. 功能富集分析

7. 蛋白互作分析

 8.网络图的构建和美化。

示例图 通路富集分析结果图

示例图 GO富集分析结果图

示例图 蛋白互作网络图

  

示例图 调控网络图

示例图 pathwaymap图

讲师宋博士简介：

 

成果：参与完成了近百篇软件著作权和发明专利的撰写和申请；肺癌、胰腺癌、骨肉瘤、胃癌等数据库的分析和构建；完成个体基因检测流程和无创唐筛流程的开发。

 

研究方向：有近十年的生信分析经验，擅长方向有转录组测序分析、芯片数据分析、疾病机理研究分析、疾病预后与基因关联分析、项目分析思路设计以及个性化分析等，精通perl、R等编程语言。

 

培训经历：在上海、沈阳、济南、武汉等城市举办过十几场培训班。培训的对象有：医生、学生、科研工作者、生信爱好者等。

培训方向：

《测序与芯片数据分析》、《生物信息学的魅力》、《生信文章实例解读》、《生信与实验的密切关系》、《生信与临床医学的关系》、《生信实用工具培训》、《多组学整合分析流程》、《R语言培训》等

学习班时间与地点（上海班）

 

上海班  培训时间：2018年5月26-27日 （2天）

培训地点： 上海好望角大饭店   上海市肇嘉浜路500号

学习办主办：医药加学习班

学习班承办方：上海遐永医药科技

学习班赞助方：尔云生信

收费标准：

 

 注册费：2500元每位（注册费包含电子版教材、午餐，住宿费自理。）

优惠政策：

1. 提前确认报名及转账的，可以提前拿到学习材料

2. 三人组团报名，每人可优惠100元

3. 四人组团报名，每人收费2300元，

4.  五人组团报名缴费，额外带一人免费注册！ 

 

可以开正规会务发票，纸质邀请函（盖红章）。 

 

特别说明：如果需要学习班的上外网路由神器，用于上google学术等国外网站，请自己在邀请函上加900元，我们会在你们的会务费发票上加900元，给您开发票，如果不需要神器，就是按照我们邀请函上的价格，神器可以至少保证用2年以后。

学习班报名方式：