单细胞分析常见问题

Posted 2023-03-16

参考技术A 前面写过一个单细胞聚类图形填充的脚本分享，发现小小技能并不能满足真实的绘图需求，在浏览过一个大神写的文章后，发现能实现的几个需求有好多。在这里以问题的形式来进行一一解答。

很多客户问到过这个问题，我们也在现场问过10X的技术人员。首先可以确定的是，不管是tsne还是umap，降维获得的细胞对于的cluster结果是一样的。所以两者均可选择。然后就是一个展示的问题了。umap在进行可视化时，采用的算法是达到局部最优，tsne达到的是整体最优。我做过的这些项目中，总结出一个规律，当细胞数目很多时，采用tsne，当细胞数目较少时，采用umap。因为图形是为了证明结论，哪种图最能展示我们的结论，该图是最佳的。

一般情况下，主成分对于细胞聚类的影响是有规律的，成分等级越高，越不容易进行细胞聚类。对于单细胞而言，不同类型的细胞marker基因的表达差别是比较明显的，因此为了较好地进行区分，我们一般选择拐点的主成分作为降维的依据。如下图所示，一般选择TOP10。

但不规律时，我们可以进行维度选择来进行聚类降维，脚本如下所示：

很多人做单细胞时，都会纠结于这个问题，分辨率太小，担心没有将细胞间的差异体现出来；分辨率太大，可能存在过度聚类的情况，而且对命名影响很大。官网上有推荐的根据细胞数来选择分辨率，将该参数设置在0.4-1.2之间，对于3K左右的单细胞数据集通常会得到良好的结果。对于较大的数据集，最佳分辨率通常会增加。针对具体的情况，判断标准可能偏主观一些。根据我的分析经历，可总结以下几点：
1）对于单个样本，主要看每个cluster的差异基因表达量热图。表现形式一般为每个cluster中其条线出来的差异基因在该cluster中表达量高，而在其他cluster中表达量低。不然，表示有些cluster还可以合并或者细分（如果出现污染或者其他情况另当别论）

2）对于有比较组的情况，除了看cluster的差异基因聚类热图外，还要关注样本之间的差异。样本之间的差别主要表现在同一个cluster中细胞数目的差别。根据比较组条件的设置，差别越大，同一个cluster的细胞数目差别也会比较大。另外差异小提琴图或者表达量气泡图也能说明问题。
可以同时设置不同的分辨率进行对比分析，脚本如下：

对于单细胞测序而言，有可能会出现测序时间、仪器或者加测的情况，形成不同的数据批次，实验误差也会反映到测序数据上，该现象就是我们常说的批次效应。该如何采用seurat进行批次效应的消除呢？

关于去除多组数据中的批次效应，有多种算法，如Seurat包的CCA(canonical correlation analysis)、LIGER的NMF(non-negative matrix factorization)、 Scran包的mnnCorrect 、Seurat包的sctransform。这里搜集了几个方法的链接，大家可以操作一下。
Seurat包的CCA： https://cloud.tencent.com/developer/article/1499846
Scran包的mnnCorrect： https://www.jianshu.com/p/b7f6a5efed85
Seurat包的sctransform： https://www.jianshu.com/p/e639cc257d51

有篇文献中有将大细胞去批次效应效果做了一个对比，设计到的方法如下图所示，测试了10个数据集，使用五个评估指标对14种方法进行对比评估，大家可以去了解一下。

参考链接：
https://zhuanlan.zhihu.com/p/122502250
https://www.jianshu.com/p/647cb81a77ac
https://www.jianshu.com/p/67d2decf5517

Seurat单细胞分析常见代码-02

参考技术A 默认是500 * 1024 ^ 2 = 500 Mb

future在seurat的具体应用详见： https://satijalab.org/seurat/archive/v3.0/future_vignette.html

CaseMatch()为seurat包内部函数， https://github.com/satijalab/seurat/blob/master/R/utilities.R

如果细胞太密，有重叠，可以设置透明度，我一般alpha.use设置0.8或者0.9

一般我常用的配色是：c("lightgrey", "red")或者c("lightgrey", "blue")

为了对比细胞间的基因表达差异，常使用不同的配色；
使用viridis调色板

可参考的配色有

我们常常用一些小的特征基因（3-5 个基因）使用 FeaturePlot() 来辅助celltype的鉴定，文献中也有此操作( https://www.nature.com/articles/s42003-020-0922-4/figures/1 )

AddModuleScore()的算法跟上面的计算基因集均值的方法不同，后面细究下源码。
AddModuleScore()为Seurat包中自带函数，需要先计算基因集中所有基因的平均值，再根据平均值把表达矩阵切割成若干份，然后从切割后的每一份中随机抽取对照基因（基因集外的基因）作为背景值。因此，在整合不同样本的情况下，即使使用相同基因集为相同细胞打分，也会产生不同的富集评分；

DotPlot的features为list时，list组间会有间隔，便于比较不同celltype的marker基因差异，可视化效果更好；

计算表达基因的细胞比例的函数，在 https://github.com/satijalab/seurat/issues/371 中有网友给出了一个自定义函数，如下：

同样，也可以计算在cluster的占比