BMG多功能酶标仪实时监测细胞凋亡和细胞坏死

Posted 2023-05-09

参考技术A CLARiostar ACU提供了在可控环境下进行细胞凋亡和细胞坏死的实时监测生理条件

多指标RealTime-Glo™ Annexin V凋亡和坏死分析试剂盒检测细胞凋亡时的磷脂酰丝氨酸外翻事件以及细胞坏死引起的细胞膜完整性丧失

简介

虽然细胞死亡是一个重要的、正常的多细胞因素动态平衡的结果，但往往在很多人类疾病中扮演不利角色。对靶向细胞毒性物质和细胞保护剂的了解将有助于对癌症、神经退行性疾病和其它一系列疾病的治疗。若要对疾病模型中，引起失调的因素以及外部刺激反应进行充分的了解，构建细胞死亡的作用机制及动力学分析过程很有必要。传统的实验方法往往存在耗时、耗费人力、代价昂贵且信息不完整的特点。

这里我们介绍一种实时监测细胞凋亡和细胞坏死的新方法。Promega公司新推出的RealTime-Glo™ Annexin V细胞凋亡和细胞坏死分析试剂盒提供了一种简单的活细胞样本“加样-读数”的实时监测实验方法。而由BMG LABTECH公司生产的CLARIOstar ACU提供了实时、同时检测发光和荧光信号，并同时维持实验样品细胞所需的[O2]和[CO2]。两者的有机组合为您提供了一个完美的无人值守的解决方案：只需加样完成开始实验，则可完全由仪器自动实时检测所需的参数，您将不会错过任何条件变化引起的重要反应参数。

RealTime-Glo™ Annexin V细胞凋亡检测

图1：RealTime-Glo™ Annexin V细胞凋亡和细胞坏死分析试剂盒原理：两个Annexin V-萤火虫荧光素酶（NanoBiT™）亚基融合蛋白转染到细胞中且在健康细胞中不会产生发光信号。当与PS相结合时将生成完整的酶并产生发光信号。而细胞膜的完整性则用改良的细胞坏死检测荧光探针来检测。

磷脂酰丝氨酸（PS）位置的改变-从细胞膜内侧外翻到细胞膜外侧被认为是正常细胞进入凋亡状态的标志信号。多重分析中利用Annexin V结合于PS来检定细胞凋亡的开始。

RealTime-Glo™ Annexin V细胞凋亡和细胞坏死分析试剂盒利用了两个Annexin-萤火虫荧光素酶（NanoBiT™）亚基融合蛋白并且只有与PS产生亲和时才形成有活性荧光素酶的特点。在两种融合蛋白亚基充足的情况下，完整酶的产生量实时报告了PS的外翻。而细胞坏死检测试剂则报告因细胞坏死引起的细胞膜膜完整性的改变。两者结合则构建了一个可实时监测的细胞死亡作用机制（细胞凋亡、原发性坏死或其它原因）。

材料和方法

RealTime-Glo™ Annexin V细胞凋亡和细胞坏死分析试剂盒(Promega, Cat #JA1011)

CLARIOstar ACU（BMG LABTECH）

白色、透明或不透明底96孔板（Costar）

K562细胞（来自ATCC）

阴性选择自然杀伤细胞（NK）（来自Lonza）

其它试剂购自市场

RealTime-Glo™ Annexin V细胞凋亡和细胞坏死分析试剂盒中所有试剂都按照说明书进行准备和加样。

对于剂量响应实验，起始最大浓度为10 μM 的bortezomib进行8个梯度系列稀释，加入到接种有10,000细胞/孔的K562细胞中，实验包括药物溶剂对照处理（Vehicle treatment）和无细胞空白对照。

NK细胞的实验中，NK细胞用IL-15处理，然后按比率接种到K562细胞中。单独的NK细胞或K562细胞作为对照。利用CLARIOstar多功能酶标仪进行检测和培养，仪器设置如下。

结果和讨论

在加入bortezomib后的48小时中，每1个小时用CLARIOstar ACU进行发光和荧光的实时双重检测（49个循环）。图8中的PS-外翻响应（发光）领先于细胞坏死响应（荧光）表明治疗型蛋白酶体抑制剂达到预期的凋亡作用。

图2：同时检测PS阳性（紫色）和膜完整性（橙色）

图3说明可以从单一的试验中获得多个时间-剂量响应曲线。结果进一步说明了应答量中剂量和时间之间的关系。试验中同时获得相类似的结果用于测定继发性坏死引起的细胞膜完整性改变（数据没有列出）。

最后的实验探究了经过刺激的自然杀伤性细胞（NK）对靶细胞的先天性能力：参与并诱导了K562癌细胞的凋亡。实验在细胞混合后的两小时内每5分钟检测一次（25个循环）。数据表明PS-外翻和细胞死亡程度与NK细胞数量成正相关关系（数据没有列出）。

图3：不同时间点凋亡的剂量应答曲线。Bortezomib药物处理（n=4）后不同时间点的剂量应答曲线。作为凋亡信号的PS外翻信号在12小时处可被仪器检测到并且在12到24小时之间呈现明显增加的状态。发光信号大小表明了凋亡发生的程度。

图4说明了NK细胞对靶细胞的比例的增加与凋亡量也就是发光信号强度之间的关系。

图4：自然杀伤细胞活力分析。RealTime-Glo™ Annexin V细胞凋亡和细胞坏死分析结果表明在低效靶比时NK细胞也存在显著的杀伤力，且随着效靶比的增加而显著提高。

结论

结果表明一种新颖的分析方法和仪器的有机结合，开创了一种无人值守且可获得出色结果的细胞凋亡和细胞坏死研究解决方案。检测结果的实时自然属性让您轻松获得以往通过繁重的凋亡分析工作才能获得的有用信息。

参考资料

1. S.J. Martin et al. (1995) J. Exp. Med. 182, 1545-1556.

2. A. S. Dixon et al. (2016) ACS Chem. Biol. 11, 400-408.

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工艺分享 || 基于代谢网络模型和AI技术预测CHO细胞营养物质消耗速率

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基因组代谢模型是一个在线监测和预测细胞从增殖到表达重组蛋白过程中培养基营养消耗的平台。这个平台面临的挑战是低估了氨基酸消耗和假设稳态导致的预测范围狭窄。本文的目标是将代谢网络模型与机器学习方法结合起来应对这些挑战，并证明了混合建模在生物过程在线控制中的作用。

建模过程

CHO细胞广泛应用于大规模且复杂的生物治疗产品，其培养过程中需要对营养物质进行谨慎监控和控制。原始预测营养消耗的模型对氨基酸浓度的预测存在过度拟合、理想和短视的缺陷，这些都削弱了它们在工业生产控制中的实用性。本文通过将代谢网络模型与机器学习相结合，可以克服上述弱点。

作者用了十种不同的CHO克隆细胞（不同克隆拥有不同的代谢表型）通过两种不同的Fed-batch工艺，来开发本文提到的方法。

在建模上，需要日常检测数据有（1）活细胞密度和滴度（计算生长速率和Qp）。（2）葡萄糖、乳酸、谷氨酸和谷氨酰胺浓度（计算消耗速率）。将这些测量值用作观察值的边界条件。使用马尔可夫链蒙特卡罗采样的代谢通量采样。

文中作者还通过用指数衰减函数模拟多相消耗曲线来解决稳态预测范围狭窄的局限。

图1.一种新的结合代谢和统计的模型预测CHO细胞不同时间培养基中的氨基酸消耗。流程图如上，关键数据用背景颜色突出，并用相同的颜色在图(a)和图(b)中展示。首先，代谢模型基于对细胞生命进程的监测如活细胞密度和葡萄糖摄取率，预测了4-6天的氨基酸的消耗率。然后，统计模型基于之前代谢模型的性能对这些预测进行改进()。引用先前消耗曲线的渐近行为作为先验()，第二个统计模型预测出培养全程的消耗曲线(  )。预测的消耗曲线与实验数据很好地一致(   )。

图2.代谢网络模型预测氨基酸消耗率。(a)模型预测与实验测量结果吻合良好，如葡萄糖和乳酸的消耗率(右上)。(b) 然而，该模型也低估了几乎所有氨基酸的消耗率(x轴)。

图3.优化模型预测营养消耗。(a) 16个氨基酸的日消耗率(不包括丙氨酸和甘氨酸)。平均而言，预测值与实验测量值的一致性在83%以内。(b) 8天培养期间消耗的氨基酸总量在实验值的86%以内。结果表明，该方法在生物反应器环境监测和预测中具有重要的应用价值。

方   法

培养基使用前必须经过无菌过滤，以防止接种前的微生物污染。本研究观察了各种细胞培养基配方的无菌过滤能力，发现过滤性能的差异是由于培养基中颗粒粒径分布的差异造成的。过滤最大通量主要由培养基内的颗粒数和粒径分布决定。利用粒子计数和粒径分布的数据，可以预测排阻颗粒的大小和过滤容量体积。本研究中显示粒径小于100nm时过滤效果最佳，在细胞培养基的成分设计，以及粉末培养基配制上，可作为培养基溶解性指标。

细胞培养实验

细胞生长速率的计算公式。

细胞代谢模型

我们使用了先前描述的代谢网络模型，再用optGpSampler和COBRApy，通过前面描述的mcmc算法，在模型的空间内随机抽样5000个点，计算可能氨基酸消耗率的分布。

统计方法

代谢模型预测：

统计模型预测：

上海多宁生物科技有限公司，是国内生物医药行业无血清培养基、一次性产品及生物反应器领域的主要供应商，致力于开发高质、高效的无血清、个性化、化学成分限定细胞培养基及动物细胞培养工艺；研发和生产用于生物制药工艺的一次性产品和生物反应器，同时为生物制药行业提供配方生产、工艺优化、工艺验证、技术支持与配套服务。

基于公司先进的培养基开发平台，现已推出可显著提高CHOK1、CHOS、DG44、CHOZN、CHOK1SV等细胞生长和生产性能的高效补料产品DN feed 2 + DN feed B2（相关介绍请点击《》，详情请咨询公司销售，或通过后台留言联系我们。